Induktion der Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor

Programmierter Zelltod bei Erythrozyten, auch bekannt als Eryptose, ist bei vielen klinischen Erkrankungen und hämatologischen Erkrankungen häufig. Eryptose ist mit Zellschrumpfung und dem Verlust der Phospholipid-Asymmetrie in der Zellplasmamembran^1,2verbunden. Der Verlust der Asymmetrie führt zur Translokation von Phosphatidylserin (PS), einem Lipid, das normalerweise in der inneren Packungsbeilage^3,4, zur äußeren Zellbroschüre lokalisiert ist, die Anmacrophagen an Phagozytose sendet und defekte Erythrozyten^5,6,7,8. Am Ende der normalen Lebensdauer von Erythrozyten sorgt die Entfernung eryptotischer Zellen durch Makrophagen für das Gleichgewicht der erythrozyten im Umlauf. Jedoch, bei kranken Bedingungen, wie Sichelzellerkrankung und Thalassämie^9,10,11, verbesserte Eryptose kann zu schwerer Anämie führen². Aufgrund seiner Bedeutung bei hämatologischen Erkrankungen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung der Faktoren, die die Eryptose auslösen oder hemmen, und der molekularen Mechanismen, die diesem Prozess zugrunde liegen.

Die Plasmamembran gesunder Erythrozyten ist asymmetrisch, wobei verschiedene Phospholipide an den äußeren und inneren Blättchen lokalisiert werden. Membranasymmetrie wird in erster Linie durch die Wirkung von Membranenzymen reguliert. Aminophospholipid translocase erleichtert den Transport von Aminophospholipiden, PS und Phosphatidylethanolamin (PE), indem diese Lipide auf die innere Packungsbeilage der Zelle geleitet werden. Auf der anderen Seite transportiert Floppase das Cholin enthaltende Phospholipide, Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SM), von der inneren zur äußeren Packungsbeilage der Zellmembran¹². Im Gegensatz zu gesunden Zellen wird die Membran eryptotischer Erythrozyten jedoch durchwühlt. Dies ist auf die Wirkung eines dritten Enzyms, Scramblase, zurückzuführen, das die Phospholipid-Asymmetrie durch die Erleichterung des bidirektionalen Transports von Aminophospholipiden^13,14,15,16stört. Scramblase wird durch erhöhte intrazelluläre Konzentrationen von Ca²⁺aktiviert. Daher sind Calciumionophore, die den Transport von Ca²⁺ über die Zellmembran¹²erleichtern, effiziente Induktoren der Eryptose.

Ionomycin, ein Calcium-Ionophor, wurde weit verbreitet, um Eryptose in Erythrozyten^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}zu induzieren. Ionomycin hat sowohl hydrophile als auch hydrophobe Gruppen, die notwendig sind, um Ca²⁺ Ion zu binden und zu erfassen und in den zytosolischen Raum^27,28,29zu transportieren. Dies führt zur Aktivierung von Scramblase und Translokation von PS in die äußere Packungsbeilage, die leicht mit Annexin-V, einem zellulären Protein mit einer hohen Affinität zu PS^12,nachgewiesen werden kann. Obwohl die Auslösung der Eryptose durch Ionomycin häufig berichtet wird, besteht eine erhebliche Methodabweichung in der Literatur (Tabelle 1). Die Population der Erythrozyten, die sich einer Eryptose unterziehen, hängt von verschiedenen Faktoren wie der Ionophorkonzentration, der Behandlungszeit mit Ionophor und dem Zuckergehalt der extrazellulären Umgebung ab (Glukose-Erschöpfung aktiviert Kationenkanäle und erleichtert den Eintritt von Ca²⁺ in den zytosolischen Raum)^30,31. Allerdings gibt es wenig Konsistenz in diesen Faktoren in der Literatur, so dass es schwierig ist, Eryptose reproduzierbar in vitrodurchzuführen.

In diesem Protokoll stellen wir ein Schrittweiseverfahren zur Induziniösisierung von Eryptose bei menschlichen Erythrozyten vor. Es werden Faktoren untersucht, die eine erfolgreiche Eryptose beeinflussen, einschließlich Ca^{2+-Konzentration,} Ionophorkonzentration, Behandlungszeit und Vorinkubation im Glukose-Erschöpften Puffer und es werden optimale Werte gemeldet. Dieses Verfahren zeigt, dass die Vorinkubation von Erythrozyten in einem glukosefreien Puffer den Prozentsatz der Eryptose im Vergleich zum glukosehaltigen Puffer signifikant erhöht. Dieses Protokoll kann im Labor verwendet werden, um eryptotische Erythrozyten für verschiedene Anwendungen zu produzieren.