概要

تحريض الخلايا الحمراء للدم باستخدام الكالسيوم الأيوني

Published: January 21, 2020
doi:

概要

يتم توفير بروتوكول لتحريض الخلايا الخلوية ، والمبرمجة موت الخلية في كريات الحمراء ، وذلك باستخدام ionophore الكالسيوم ، ionomycin ،. يتم تقييم المبرمج الناجح من خلال مراقبه التعريب فوسفاتيديلسيرين في النشرة الخارجية غشاء. وقد تم فحص العوامل التي تؤثر علي نجاح البروتوكول وتوفير الظروف المثلي.

Abstract

كريات الخلايا المبرمجة الموت ، يحدث في عدد من الامراض الدموية واثناء أصابه الكريات الحمراء. السمة المميزة للخلايا eryptotic هو فقدان التماثل الموضعي لغشاء الخلية ، مما يؤدي إلى نقل فوسفاتيديلسيسيرين إلى النشرة الخارجية غشاء. يتم تشغيل هذه العملية عن طريق زيادة تركيز داخل الخلايا من Ca2 +، والذي ينشط تشويش blase ، وهو الانزيم الذي يسهل حركه ثنائيه الاتجاه من الدهون الفوسفاتية بين المنشورات غشاء. ونظرا لاهميه الخلايا البينية في الظروف المرضية المختلفة, وكانت هناك جهود للحث علي الارطح في المختبر. وقد اعتمدت هذه الجهود عموما علي ionophore الكالسيوم, ionomycin, لتعزيز Ca داخل الخلايا2 + تركيز والحث علي الارطح. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن العديد من التناقضات في الأدبيات المتعلقة بالاجراء الخاص بحمل الخلايا البينية باستخدام ionomycin. هنا ، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول خطوه بخطوه ل ionomycin المستحثة في كريات الحمراء البشرية. ونحن نركز علي الخطوات الهامه في الاجراء بما في ذلك تركيز ايوكوفيري ، ووقت الحضانة ، واستنزاف الجلوكوز ، وتوفير نتيجة تمثيليه. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتكرار حث الخلايا البينية في المختبر.

Introduction

موت الخلايا المبرمجة في كريات الدم الحمراء ، والمعروف أيضا باسم الخلية ، هو شائع في العديد من الحالات السريرية والاضطرابات الدموية. ويرتبط اريبتوسيس مع انكماش الخلية وفقدان التماثل فوسفورية في غشاء البلازما الخلية1,2. فقدان عدم التماثل النتائج في نقل فوسفاتيديلسيسيرين (PS), الدهون المترجمة عاده في النشرة الداخلية3,4, إلى النشرة الخارجية الخلية, الذي يشير إلى الضامة لفاجوسيتوسي وأزاله الكريات الحمراء المعيبة5,6,7,8. في نهاية فتره الحياة الطبيعية من كريات الدم الحمراء ، وأزاله الخلايا الدموية من قبل الضامة يضمن التوازن من كريات الدم الحمراء في التداول. ومع ذلك ، في الظروف المرضية ، مثل مرض الخلية المنجلية و الثلاسيميا9،10،11، قد يؤدي تحسين الخلايا الخلوية إلى فقر الدم الشديد2. نظرا لأهميته في امراض الدم ، هناك اهتمام كبير في دراسة العوامل التي تحفز أو تمنع الخلايا الخلوية واليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية.

غشاء البلازما من كريات الدم الحمراء الصحية غير متناظرة ، مع الفوسفورية المختلفة التعريب في المنشورات الخارجية والداخلية. يتم تنظيم التماثل غشاء في المقام الأول من قبل عمل الانزيمات الغشاء. Aminophospholipid translocase يسهل نقل أمينوفوسفوليبيدس ، PS و فوسفهاتيديليثانولامين (PE) ، من خلال توجيه هذه الدهون إلى النشرة الداخلية الخلية. من ناحية أخرى, floppase ينقل الكولين التي تحتوي علي الدهون الفوسفاتية, فوسفاتيديلكولين (PC) و سفينغوميلين (SM), من الداخل إلى النشرة الخارجية لغشاء الخلية12. ومع ذلك ، علي عكس الخلايا السليمة ، يتم خلط غشاء الكريات الحمراء الخلوية. ويرجع ذلك إلى عمل الانزيم الثالث ، الذي يعطل التباين فوسفورية عن طريق تسهيل النقل ثنائي الاتجاه من أمينوفوسفوليبيدس13،14،15،16. يتم تنشيط تشويش بلاسي من خلال مستويات مرتفعه من الخلايا من Ca2 +. ولذلك ، ionophores الكالسيوم ، والتي تسهل نقل Ca2 + عبر غشاء الخلية12، هي محفزات فعاله من الخلايا البينية.

Ionomycin ، ايونومور الكالسيوم ، وقد استخدمت علي نطاق واسع للحث علي الخلايا الحمراء في كريات الصدر12،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26. Ionomycin لديه كل من المجموعات هيدروفيلييك ومسعور ، والتي هي ضرورية لربط والتقاط Ca2 + أيون ، ونقله إلى الفضاء عصاري خلوي27،28،29. وهذا يؤدي إلى تفعيل التشويش ونقل الموقع من PS إلى النشرة الخارجية ، والتي يمكن الكشف عنها بسهوله باستخدام الملحقات-V ، وهو بروتين خلوي مع تقارب عاليه إلى PS12. وعلي الرغم من انه يتم الإبلاغ عن الآثار التي يسببها ionomycin عاده ، وهناك تباين طريقه كبيره في الأدب (الجدول 1). يعتمد السكان من كريات الحمراء التي تمر بالخلايا الخلوية علي عوامل مختلفه مثل تركيز ايوكوفيري ، ووقت العلاج مع ايوفونور ، ومحتوي السكر في البيئة خارج الخلية (استنزاف الجلوكوز ينشط قنوات الموجبة ويسهل دخول Ca2 + في الفضاء عصاري خلوي)30،31. ومع ذلك ، هناك القليل من الاتساق في هذه العوامل في الأدبيات ، مما يجعل من الصعب القيام التكرار في المختبر.

في هذا البروتوكول ، نقدم اجراء خطوه بخطوه للحث علي الارطح في كريات الحمراء البشرية. يتم فحص العوامل التي تؤثر علي الخلايا البينية الناجحة بما في ذلك Ca2 + تركيز ، تركيز ايوكوفيري ، وقت العلاج ، وما قبل الحضانة في المخزن المؤقت المنضب الجلوكوز ويتم الإبلاغ عن القيم المثلي. يوضح هذا الاجراء ان ما قبل الحضانة من كريات الحمراء في المخزن المؤقت الخالي من الجلوكوز يزيد بشكل كبير من نسبه الخلايا البينية مقارنه بالمخزن المؤقت المحتوي علي الجلوكوز. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر لإنتاج كريات الحمراء الخارجية للتطبيقات المختلفة.

Protocol

وقد تم شراء جميع عينات الدم البشرية المستخدمة في البروتوكول الموصوف أدناه كعينات تم التعرف عليها. ولم يشارك في هذه الدراسة اي أشخاص من البشر أو جندوا بصوره مباشره. وينبغي استخدام المبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي عندما تشمل البحوث المواضيع البشرية. 1-العزلة الكرياته عن الدم ا?…

Representative Results

تحسين تركيز ايونوميمايسين في حين ان ionomycin مطلوب للحث علي الخلايا الدموية ، يمكن ان تؤدي زيادة تركيزات ionomycin إلى انحلال الدم (اي تحلل كريات الدم الحمراء وإفراز الهيموجلوبين) ، والذي يحتاج إلى تجنب. علاج الكريات الحمراء مع ionomycin 1 μM …

Discussion

والهدف من هذا الاجراء هو توفير القيم المثلي لتركيز ايوكوفيري ، والوقت العلاج ، وتركيز الجلوكوز خارج الخلية ، والتي هي عوامل هامه في ضمان الحث الناجح للارطح. ومن الخطوات الحاسمة في البروتوكول استنفاد الجلوكوز خارج الخلية ، والتي ، علي الرغم من أهميتها ، لم يتم التاكيد بما فيه الكفاية في ال?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحه R15ES030140 و NSF منحه CBET1903568. ومن المسلم به أيضا الدعم المالي من كليه روس للهندسة والتكنولوجيا وقسم الهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية في جامعه أوهايو.

Materials

96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

参考文献

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. 代謝. 39 (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 – a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. 生化学. 46 (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte “Programmed Cell Death” Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. . Flow Cytometry Protocols. , (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte’s Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics – Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).

Play Video

記事を引用
Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

View Video