マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

各単一細胞の転写プロファイルは、胚発生中の細胞集団によって異なる。situハイブリダイゼーションにおける単一分子は、少数の遺伝子¹の発現を可視化するために使用することができるが、単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)は、単一細胞における遺伝子のゲノムワイド発現パターンを例示する偏りのないアプローチを提供する。^2009年2月に最初に出版された後、scRNA-Seqは、近年^3、4、5の複数の発達段階で複数の組織を研究するために適用されている。また、ヒト細胞アトラスが最近発達に焦点を当てたプロジェクトを立ち上げているため、近い将来、ヒト胚組織からの単一細胞データの生成が期待されています。

最初に発達する臓器としての心臓は胚発生において重要な役割を果たす。心臓は複数の細胞型で構成され、各細胞型の発達は時間的および空間的に厳密に調節される。ここ数年、初期の発達段階における心臓細胞の起源と細胞系統は、先天性心疾患の病因を理解するための非常に有用なナビゲーションツールを提供する⁶を特徴とし、心筋細胞再生⁷を刺激するより技術的に高度な方法を開発する。

scRNA-Seqは、近年^8、9、10で急速な拡大を遂げています。新たに開発された方法により、単一細胞実験の設計と解析がより達成可能になりました^。ここで提示する方法は、液滴溶液に基づく商業手順である(材料表を参照^)15、16。この方法は、マイクロ流体コントローラシステムの制御下にある油水エマルジョン液滴中の細胞および一意にバーコードされたビーズのセットを捕捉することを特徴とする。液滴への細胞負荷の速度は極めて低く、液滴エマルションの大部分は1つの細胞¹⁷のみを含む。この手順の独創的な設計は、バーコードングと同時に発生する液滴エマルジョンへの単一細胞分離から来ており、異種集団でRNA-Seqを使用して個々の細胞の並列分析を可能にします。

多重化戦略の組み込みは、従来の単一細胞ワークフロー^13、14への重要な追加の1つである。この添加は、細胞ダブレットを廃棄し、実験コストを削減し、バッチ効果^18、19を排除するのに非常に有用である。脂質ベースのバーコードング戦略と抗体ベースのバーコードング戦略(材料表参照)は、主に多重化法の2つである。特定のバーコードを使用して両方の方法で各サンプルにラベルを付け、ラベル付きサンプルを混合して単一セルのキャプチャ、ライブラリの準備、およびシーケンス処理を行います。その後、バーコードシーケンスを分析することによって、プールされたシーケンスデータを分離することができます (図 1)¹⁹.ただし、2 つの方法には大きな違いがあります。脂質ベースのバーコード戦略は、脂質修飾オリゴヌクレオチドに基づいており、細胞型の好みを有することが見つかっていない。抗体ベースのバーコードング戦略は、抗原タンパク質^19、20を発現する細胞のみを検出できるが。また、脂質を染色するのに約10分かかりますが、抗体を染色するのに40分かかります(図1)。さらに、脂質修飾オリゴヌクレオチドは抗体共役オリゴヌクレオチドよりも安価であるが、本稿の執筆時点では市販されていない。最後に、脂質ベースの戦略は1回の実験で96サンプルを多重化できますが、抗体ベースの戦略は現在12サンプルしか多重化できません。

単一の実験で多重化する推奨細胞数は2.5 x 10⁴より小さくする必要があり、そうでなければ、細胞ダブレットの高い割合と潜在的な周囲mRNA汚染につながります。多重化戦略により、複数のサンプルの単一セルキャプチャ、cDNA生成、ライブラリ調製のコストは1サンプルのコストに削減されますが、シーケンシングコストは変わりません。