概要

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Published: January 07, 2020
doi:

概要

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d’ARNm de cellules simples pour profiler l’expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l’ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Abstract

Le séquençage de l’ARNm à cellule unique a fait des progrès significatifs au cours des dernières années et est devenu un outil important dans le domaine de la biologie du développement. Il a été utilisé avec succès pour identifier les populations de cellules rares, découvrir de nouveaux gènes marqueurs et décoder l’information sur le développement spatial et temporel. La méthode à cellule unique a également évolué de la technologie Fluidigm C1 à base de microfluidique aux solutions à base de gouttelettes au cours des deux à trois dernières années. Ici, nous avons utilisé le cœur comme un exemple pour démontrer comment profiler les cellules de tissu embryonnaire de souris en utilisant la méthode scRNA-Seq basée sur les gouttelettes. En outre, nous avons intégré deux stratégies dans le flux de travail pour profiler plusieurs échantillons dans une seule expérience. En utilisant l’une des méthodes intégrées, nous avons simultanément profilé plus de 9 000 cellules à partir de huit échantillons de cœur. Ces méthodes seront précieuses pour le domaine de la biologie du développement en fournissant un moyen rentable de profiler simultanément des cellules individuelles provenant de différents milieux génétiques, stades de développement ou endroits anatomiques.

Introduction

Le profil transcriptionnel de chaque cellule varie selon les populations cellulaires au cours du développement embryonnaire. Bien que l’hybridation moléculaire in situ unique puisse être utilisée pour visualiser l’expression d’un petit nombre de gènes1, le séquençage de l’ARNm à cellule unique (scRNA-Seq) fournit une approche impartiale pour illustrer les modèles d’expression à l’échelle du génome des gènes dans les cellules individuelles. Après sa première publication en 20092, scRNA-Seq a été appliqué pour étudier plusieurs tissus à plusieurs stades de développement au cours des dernières années3,4,5. De plus, comme l’atlas des cellules humaines a lancé récemment ses projets axés sur le développement, on s’attend à ce que davantage de données sur les cellules individuelles provenant de tissus embryonnaires humains soient générées dans un proche avenir.

Le cœur en tant que premier organe à se développer joue un rôle critique dans le développement embryonnaire. Le cœur se compose de plusieurs types de cellules et le développement de chaque type de cellule est étroitement réglementé temporellement et spatialement. Au cours des dernières années, l’origine et la lignée cellulaire des cellules cardiaques aux premiers stades de développement ont été caractérisées6, qui fournissent un outil de navigation extrêmement utile pour comprendre la pathogénie congénitale des maladies cardiaques, ainsi que pour le développement de méthodes plus avancées technologiquement pour stimuler la régénération cardiomyocyte7.

Le scRNA-Seq a subi une expansion rapide ces dernières années8,9,10. Avec les méthodes nouvellement développées, la conception et l’analyse des expériences à cellule unique est devenue plus réalisable11,12,13,14. La méthode présentée ici est une procédure commerciale basée sur les solutions droplet (voir Tableau des Matériaux)15,16. Cette méthode consiste à capturer des cellules et des ensembles de perles codées à barres uniques dans une gouttelette d’émulsion d’huile-eau sous le contrôle d’un système de contrôleur microfluidique. Le taux de chargement cellulaire dans les gouttelettes est extrêmement faible de sorte que la majorité des émulsions de gouttelettes ne contiennent qu’une seule cellule17. La conception ingénieuse de la procédure provient de la séparation d’une seule cellule en émulsions de gouttelettes se produisant simultanément avec le codage à barres, qui permet l’analyse parallèle des cellules individuelles utilisant l’ARN-Seq sur une population hétérogène.

L’incorporation de stratégies de multiplexage est l’un des ajouts importants au flux de travail traditionnel à cellule unique13,14. Cet ajout est très utile dans le rejet des doublets cellulaires, la réduction des coûts expérimentaux, et l’élimination des effets de lot18,19. Une stratégie de codage à barres basée sur les lipides et une stratégie de codage à barres à base d’anticorps (voir Tableau des matériaux) sont les deux méthodes de multiplexage principalement utilisées. Des codes-barres spécifiques sont utilisés pour étiqueter chaque échantillon dans les deux méthodes, et les échantillons étiquetés sont ensuite mélangés pour la capture d’une seule cellule, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. Par la suite, les données de séquençage mises en commun peuvent être séparées en analysant les séquences de codes à barres (Figure 1)19. Cependant, des différences significatives existent entre les deux méthodes. La stratégie de codage à barres à base de lipides est basée sur des oligonucléotides modifiés par les lipides, qui n’ont pas eu de préférences de type cellulaire. Alors que la stratégie de codage à barres à base d’anticorps ne peut détecter que les cellules exprimant les protéines d’antigène19,20. En outre, il faut environ 10 min pour tacher les lipides, mais 40 min pour tacher les anticorps (Figure 1). En outre, les oligonucléotides lipides modifiés sont moins chers que les oligonucléotides conjugués aux anticorps, mais ne sont pas disponibles dans le commerce au moment de la rédaction de cet article. Enfin, la stratégie à base de lipides peut multiplex96 échantillons dans une expérience, mais la stratégie basée sur les anticorps ne peut actuellement multiplex 12 échantillons.

Le nombre de cellules recommandée au multiplexe dans une seule expérience devrait être inférieur à 2,5 x 104, sinon, il conduira à un pourcentage élevé de doublets cellulaires et la contamination potentielle de l’ARNm ambiant. Grâce aux stratégies de multiplexage, le coût de la capture d’une seule cellule, de la production d’ADNc et de la préparation de plusieurs échantillons sera réduit au coût d’un échantillon, mais le coût de séquençage demeurera le même.

Protocol

La procédure animale est conforme au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh (IACUC). 1. Dissection cardiaque embryonnaire de souris et préparation de suspension de cellules simples REMARQUE : Cette étape peut prendre quelques heures en fonction du nombre d’embryons à disséquer. Pour acquérir des cœurs embryonnaires E18.5, euthanasiez une souris CD1 enceinte par administration de CO2. Ut…

Representative Results

Dans cette étude, nous avons utilisé le cœur embryonnaire de souris comme exemple pour montrer comment le séquençage multiplexé d’ARNm à cellule unique a été exécuté pour traiter les différents échantillons des parties séparées d’un organe simultanément. Les coeurs de souris CD1 d’E18.5 ont été isolés et disséqués dans l’oreillette gauche (LA), l’oreillette droite (RA), le ventricule gauche (LV) et le ventricule droit (RV). Les cellules auriculaires et ventriculaires …

Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré un protocole pour analyser des profils transcriptionnels d’une seule cellule. Nous avons également fourni deux méthodes facultatives aux échantillons de multiplexe dans le flux de travail scRNA-Seq. Les deux méthodes se sont avérées réalisables dans divers laboratoires et ont fourni des solutions pour exécuter une expérience de cellule unique rentable et sans effet de lot18,26.

Il y a q…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions David M. Patterson et Christopher S. McGinnis du laboratoire Dr Zev J. Gartner pour leur aimable approvisionnement en réactifs à barres à base de lipides et leurs suggestions sur les étapes expérimentales et l’analyse des données. Ce travail a été fondé par les National Institutes of Health (HL13347202).

Materials

10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

参考文献

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記事を引用
Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

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