概要

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Published: January 07, 2020
doi:

概要

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Abstract

Enkelvoudige cel mRNA-sequencing heeft in de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt en is uitgegroeid tot een belangrijk instrument op het gebied van ontwikkelingsbiologie. Het is met succes gebruikt om zeldzame celpopulaties te identificeren, nieuwe marker genen te ontdekken en ruimtelijke en temporele ontwikkelings informatie te decoderen. De methode met één cel is ook geëvolueerd van de microfluïdische gebaseerde Fluidigm C1-technologie naar de droplet-gebaseerde oplossingen in de laatste twee tot drie jaar. Hier gebruikten we het hart als een voorbeeld om te laten zien hoe de muis embryonale weefselcellen te profiel met behulp van de druppel gebaseerde scRNA-SEQ methode. Daarnaast hebben we twee strategieën geïntegreerd in de workflow voor het profiel van meerdere samples in één experiment. Met behulp van een van de geïntegreerde methoden, hebben we gelijktijdig meer dan 9.000 cellen geprofileerd uit acht hart monsters. Deze methoden zullen waardevol zijn voor het ontwikkelingsbiologie veld door een kosteneffectieve manier te bieden om afzonderlijke cellen tegelijkertijd te Profiel van verschillende genetische achtergronden, ontwikkelingsstadia of anatomische locaties.

Introduction

Het transcriptionele profiel van elke afzonderlijke cel varieert tussen de celpopulaties tijdens de embryonale ontwikkeling. Hoewel enkelvoudige moleculaire in-situ hybridisatie kan worden gebruikt om de uitdrukking van een klein aantal genen1te visualiseren, biedt een enkelvoudige cel mRNA-sequencing (Scrna-SEQ) een onpartijdige benadering om genoom-brede expressie patronen van genen in afzonderlijke cellen te illustreren. Nadat het voor het eerst werd gepubliceerd in 20092, is scrna-SEQ toegepast om meerdere weefsels te bestuderen in meerdere ontwikkelingsstadia in de laatste jaren3,4,5. Ook, omdat de Human Cell Atlas onlangs zijn ontwikkelingsgerichte projecten heeft gelanceerd, worden er in de nabije toekomst meer enkelvoudige celgegevens van menselijke embryonale weefsels naar verwachting gegenereerd.

Het hart als het eerste orgel om te ontwikkelen speelt een cruciale rol in de embryonale ontwikkeling. Het hart bestaat uit meerdere celtypen en de ontwikkeling van elk celtype is strak gereguleerd, tijdelijk en ruimtelijk. In de afgelopen jaren, de oorsprong en celafstamming van cardiale cellen in vroege ontwikkelingsstadia zijn gekenmerkt6, die bieden een enorme nuttige navigatie tool voor het begrijpen van aangeboren hart-en vaatziekten pathogenese, evenals voor het ontwikkelen van meer technologisch geavanceerde methoden te stimuleren hartspier regeneratie7.

De scrna-SEQ heeft de laatste jaren8,9,10een snelle expansie ondergaan. Met de nieuw ontwikkelde methodes is het ontwerp en de analyse van eencellige experimenten meer haalbaar geworden11,12,13,14. De hier gepresenteerde methode is een commerciële procedure gebaseerd op de druppel oplossingen (Zie tabel met materialen)15,16. Deze methode is voorzien van het vastleggen van cellen en sets van unieke met kralen in een olie-water emulsie druppel onder controle van een microfluïdisch controller systeem. De snelheid van het laden van cellen in de druppels is extreem laag, zodat de meerderheid van de druppel emulsies slechts één cel17bevatten. Het ingenieuze ontwerp van de procedure komt van scheiding van één cel tot druppel emulsies die gelijktijdig met barcoding plaatsvinden, waardoor de parallelle analyse van afzonderlijke cellen met behulp van RNA-SEQ op een heterogene populatie mogelijk is.

De integratie van multiplexing strategieën is een van de belangrijke toevoegingen aan de traditionele single cell workflow13,14. Deze toevoeging is zeer nuttig bij het verwijderen van celdubbeltjes, het reduceren van experimentele kosten en het elimineren van batch-effecten18,19. Een lipide-gebaseerde barcoding strategie en een antilichaam gebaseerde barcoding strategie (Zie tabel van de materialen) zijn de twee meest gebruikte multiplexing methoden. Specifieke streepjescodes worden gebruikt om elk monster in beide methoden te labelen, en de gelabelde voorbeelden worden vervolgens gemengd voor het vastleggen van één cel, het voorbereiden van bibliotheken en sequentiëren. Daarna kunnen de verzamelde sequentie gegevens worden gescheiden door de barcode sequenties te analyseren (Figuur 1)19. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen de twee methoden. De lipide-gebaseerde barcoding strategie is gebaseerd op lipide-gemodificeerde oligonucleotiden, die niet is gebleken dat een voorkeuren voor het celtype. Terwijl de op antilichamen gebaseerde barcoderende strategie alleen de cellen kan detecteren die de antigeen-eiwitten19,20uitdrukken. Bovendien duurt het ongeveer 10 minuten om de lipiden te vlekken, maar 40 min om de antilichamen te vlekken (Figuur 1). Bovendien zijn de lipide-gemodificeerde oligonucleotiden goedkoper dan antilichamen-geconjugeerde oligonucleotiden, maar niet commercieel beschikbaar op het moment van schrijven van dit artikel. Tot slot, de lipide-gebaseerde strategie kan multiplex 96 monsters in één experiment, maar de antilichaam gebaseerde strategie kan momenteel alleen multiplex 12 monsters.

Het aanbevolen celnummer voor multiplex in een enkel experiment moet lager zijn dan 2,5 x 104, anders zal het leiden tot een hoog percentage van celdubbeltjes en potentiële omgevings-mRNA besmetting. Door middel van de multiplexing strategieën, de kosten van het vastleggen van één cel, cDNA generatie en bibliotheek voorbereiding voor meerdere monsters worden gereduceerd tot de kosten van één steekproef, maar de sequentiëren kosten blijft hetzelfde.

Protocol

De dier procedure is in overeenstemming met de Universiteit van Pittsburgh institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC). 1. embryonale hart dissectie van de muis en voorbereiding van de suspensie voor één cel Opmerking: deze stap kan een paar uur duren, afhankelijk van het aantal embryo’s dat moet worden ontleden. Om E 18.5 embryonale harten te verwerven, euthaneëren een zwangere CD1 muis door CO2 administratie. Gebruik een scheermes…

Representative Results

In deze studie gebruikten we de muis embryonale hart als een voorbeeld om te exposeren hoe Multiplexed single cell mRNA sequencing werd uitgevoerd om de verschillende monsters uit afzonderlijke delen van een orgaan tegelijkertijd te verwerken. E 18.5 CD1 muis harten werden geïsoleerd en ontleed in linker Atrium (LA), rechter Atrium (RA), linker ventrikel (LV) en rechter ventrikel (RV). De atriale en ventriculaire cellen werden vervolgens onafhankelijk van elkaar met behulp van een op lip…

Discussion

In deze studie hebben we een protocol getoond om transcriptionele profielen van één cel te analyseren. We hebben ook twee optionele methoden beschikbaar gesteld voor het multiplex van samples in de scRNA-SEQ-workflow. Beide methoden zijn haalbaar gebleken bij verschillende laboratoria en aangeboden oplossingen voor het uitvoeren van een kostenbesparend en batch-effect-vrije eencellige experiment18,26.

Er zijn een paar stappen die zor…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken David M. Patterson en Christopher S. McGinnis van Dr. Zev J. Gartner Lab voor hun vriendelijke aanbod van de op lipide gebaseerde barcoderende reagentia en suggesties voor de experimentele stappen en data-analyse. Dit werk werd opgericht door de National Institutes of Health (HL13347202).

Materials

10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

参考文献

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
  22. . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
  23. . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
  24. . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)

Play Video

記事を引用
Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

View Video