通过基因表达分析的改良方法从谷物种子获取高质量的转录数据

1. 总RNA提取和纯化 注：始终在烟罩下工作，因为这种方法涉及使用有害的挥发性有机溶剂。在开始实验之前，在50°C热块中预加热无核酸水的微熔管。这种无核酸水将用于从步骤1.8中的自旋柱中分离出总RNA。 另外，使用消毒的砂浆和在液氮中预冷却的虫子，将样品（每个样本至少三个生物复制体）研磨成细粉末。 使用浸入液氮的小金属铲将粉末状样品倒入 2.0 mL 无核酸化微熔管中，同时预浸于液氮中。立即将样品存放在超低温冷冻室（-80°C），直到分配用于批量RNA提取（STOP POINT）的一天。注：种子样品可以磨成细粉，有或不脱粒。对于大米，我们通常研磨样品而不脱壳，因为外壳含有二氧化硅，可以在研磨过程中帮助。注意：此步骤必须在严格低温条件下快速完成。自动化的一个选择是使用低温球磨机研磨样品，以尽量减少RNA降解和质量恶化。 使用大约 200 毫克的原始粉末样品获取粗RNA提取物。单独将每个样品添加到含有750μLRNA提取缓冲液（100 mM Tris、pH 8.0、150 mM LiCl、50 mM EDTA、1.5%SDS、1.5%2-汞酮乙醇）和500μL苯酚：氯仿：硫酰（25：24：1）的无核酸微熔管中。 使用高速设置的多管涡旋混合器，在室温下同时混合所有样品 5 分钟。立即将所有管子放在冰上两分钟。注意：始终在烟罩内工作，尤其是涉及苯酚、氯仿和其他有机溶剂的所有步骤。理想情况下，使用宽烟罩，可以容纳一台台式离心机、涡旋混合器、多管涡旋混合器和多管旋转混合器。 在14，000 x g的离心下将粗RNA提取物从碎片中分离10分钟。在此部分的相同设置中执行所有离心步骤。 将大约 800 μL 的上清液转移到含有 400 μL 1.2 M NaCl 和 700 μL 异丙醇的新型 2.0 mL 微熔管中。通过反转 5x 轻轻混合溶液。 通过在常规（-20°C）或超低温冷冻室（-80°C）孵育至少1小时（或过夜）沉淀RNA。停止或暂停点：只需将样品保持在常规 -20°C 冰柜中，暂停几个小时。对于过夜或较长的停止点，将样品存放在超低温冰柜 （-80 °C） 中。 在18，800 x g的离心下获得一个粗RNA颗粒，15分钟。丢弃上清液后，使用微型试剂盒（材料表）通过柱纯化纯化粗RNA颗粒。 将颗粒溶解在新鲜制备的 450 μL RLT 缓冲液中（在使用前，每 100 mL RLT 缓冲液中加入 100 μL 的 β-甲醇，每天新鲜制备）。通过在多管涡旋混合器中混合所有管在室温下至少 5 分钟，增强所有颗粒的溶解性。 通过紫色迷你旋转柱，用2 mL收集管来净化溶解的RNA颗粒。在室温下离心1分钟，在9，000 x g下，并丢弃紫色迷你旋转柱。 将 0.5 体积的绝对乙醇 （±225 μL） 添加到 2 mL 收集管中的清除电解质中。使用相同的塑料尖端混合溶液，向上和向下移液几次。 通过立即将溶液转移到带有 2 mL 收集管的粉红色迷你旋转柱，收集纯化 RNA。在 9，000 x g下离心 15 秒，将RNA收集到粉红色最小旋转柱的硅膜上。在9，000 x g的15 s下，以350μL的缓冲RW1离心，丢弃流和洗涤RNA。 通过将稀释后的DNase 1（50 μL冷冻DNase原料+ 350 μL的RDD使用DNase集）直接加入膜，并在室温下孵育至少15分钟（PAUSE POINT），去除污染基因组DNA。 通过加入 350 μL 的 RW1 并以 9，000 x g旋转 15 s. 重复两次，但这次用 500 μL 的缓冲 RPE 冲洗，从而洗掉 DNase 1。转移到一个新的2 mL收集管，并在9，000 x g旋转2分钟干燥。 将干燥的旋转柱转移到新的 1.5 mL 无核酸收集管。加入50μL的无核酸水（在50°C预暖），在50°C热块下孵育3分钟，开始纯化RNA提取物的洗脱过程。 孵育后，将RNA提取物总提取物从心放在9，000 x g上1分钟。立即将所有样品放在冰上。 使用各自的制造商协议，在纳米滴和生物分析仪中运行适当的稀释液（通常为1：10），确定总RNA提取物的数量和质量。RNA提取物至少应具有8.0的RIN值和50纳克/μL的浓度。图1显示了从大麦叶和种子中获得的RNA提取物的典型结果。停止点：将样品存放在-80°C中，直到使用。 2. cDNA合成，后经cRNA转录和标签 注：此步骤适用于同时处理 24 个样品。建议在一天内连续执行整个步骤，但会确定可选的停止点和暂停点。在开始以下步骤之前，请务必在 80°C、65 °C 和 37 °C 下预热三个微熔管热块。这些温度设置将更改，如以下步骤所述。例如，在准备 Spike 混合后（或者如果之前已准备好），37 °C 热块将设置为 40°C。根据制造商的说明，使用低输入快速放大器基因表达标签套件（参见材料表）准备单色尖峰混合、T7 启动器混合和 cDNA 主混音。这种制备取决于起始RNA提取物的量，通常总RNA为10至200纳克，聚脂酸酯为5纳。我们经常使用50 ng总RNA作为微阵列杂交2的起始材料，以及下面将介绍的方法。在为 24 个样本准备主混合物时，添加 2 个额外的反应以考虑移液变异。在此步骤中，始终使用无核酸微熔管和无核酸水。 由于产量高，通常稀释RNA提取物100倍，以适应50-100纳克的范围。基于步骤 1.9 中的 RNA 定量结果，通过在 1.5 mL 微熔管中加入 1 μL 纯化RNA提取物，使 1：100 稀释。使用纳米滴确定这种稀释的实际浓度。 在1.5mL微熔胶管中对每个总RNA样品进行第二次稀释，使总RNA的50纳克最终体积为1.5μL。 根据制造商的说明准备 Spike 混合。这一步也总结在Püffeld等人2019年2。为此，请使用 37 °C 热块。将单色尖刺的第一次和第二次稀释混合正控制储存在超低温冰柜 （-80 °C） 中，并且只经过八个重复的冻结/解冻周期。 每天准备第三和第四稀释。使用前，解冻并储存在冰上的第三和第四稀释尖刺混合物。注：在准备 Spike 混合时（或者如果以前已准备好），将 37 °C 热块的温度转换为 40 °C。 在使用前准备 T7 促销器混合物并储存在冰上。以下内容足以满足 24 个样本：20.8 μL T7促进剂底漆• 26.0 μL 无核酸水• 总体积 T7 启动器混合的 46.8 μL 将 1.8 μL 的 T7 促进剂底漆混合物（步骤 2.3）添加到每个微熔体管中，该管含有步骤 2.1 中的 1.5 μL 50 纳RNA 样品。通过移液几次，正确混合组件。通过在65°C热块中孵育10分钟，使RNA模板底漆混合变性。立即将微熔管放在冰上，为下一步做准备。 在变性模板底漆混合物（步骤 2.4）时，在 80°C 预热 5x 第一链缓冲液至少 4 分钟。 根据制造商的说明，从低输入快速放大器标签套件（参见材料表）快速准备 cDNA 合成主混合物（参见材料表）。以下内容足以应对 24 种反应：52.0 μL 预热 5x 第一链缓冲液（步骤 2.5）• 26.0 μL 0.1M DTT• 13.0 μL 的 10 mM dNTP 混合• 31.2 μL 的 RNase 块混合• 总体积 cDNA 合成主混合的 122.2 μL 解冻冰上的每个部件。通过温和的移液混合每个分量。使用前，将主混合保持在室温下。注意：使用后应立即将 RNase 块混合重新放入 -20°C 冰柜中。 取出冰上的RNA模板底漆混合物（步骤2.4），在室温下短暂离心，将所有内容物旋转到微熔管的底部。为每个管分配4.7 μL的cDNA主混合（步骤2.5），通过上下移液仔细混合。添加所有组件时的总体积应为 8.0 μL。 在40°C热块中合成2小时cDNA。在 2 h 的孵育过程中，将 65°C 热块的温度移至 70°C，为热失活做准备（步骤 2.7）。可选暂停点：将样品存放在 -80°C 过夜。实验可以在热失活后的第二天继续进行（步骤2.7）。 将每个管在 70°C 热块中孵育 15 分钟，以加热灭活 RNase 块混合。立即将管子转移到冰上，孵育至少5分钟。 当样品在冰上5分钟（步骤2.7），快速准备转录主混合。所有组件都可以在室温下组合，但可在冰上解冻部件。以下内容足以满足 24 个样本：19.5 μL无核酸水• 83.2 μL 的 5 倍转录缓冲液• 15.6 μL 0.1M DTT• 26.0 μL 的 NTP 混合• 5.5 μL T7 RNA聚合酶混合物• 6.2 μL 的氰氨酸 3-CTP （Cy3）• 总体积转录主混合的 156.0 μL注意：T7 RNA聚合酶混合物应保存在-20°C冰柜中，并在使用后立即放回。此外，Cy3对光敏感。因此，混合（步骤 2.9）和点胶（步骤 2.10）应在低光照条件下进行。为此，我们通常会关闭实验室工作台正上方的任何光线。 由于管子受到突然加热和冷却（步骤 2.7），使用微离心机短暂旋转每个样品的内容，以收集每个微熔管底部的所有液体。通过轻轻上下移液，加入6 μL的转录主混合（步骤2.8）。此反应的总量在此阶段应为 16 μL。在40°C下孵育管2小时，以产生Cy3标记的cRNA。可选停止点：转录后，管子可以储存在-80°C。 在生成 cRNA（步骤 2.9）时，将热块的温度设置为 55°C。在热块中加入至少一个无核酸水的微熔管。这种无核酸水将用于纯化cRNA的洗脱。 在 cRNA 转录和标记后，使用 RNeasy Mini Kit 进行纯化标记的 cRNA，详见步骤 3 中。 3. cRNA 纯化 使用 RNeasy 迷你套件净化标记的 cRNA（参见材料表）。根据制造商的说明准备缓冲区。例如，缓冲 RPE 以集中形式在套件中提供。使用前，加入4卷分子生物学等级绝对乙醇（96-100%）。 在每个样品中加入84μL的无核酸水，将总体积调整到100μL。然后，在每个管中加入350μL的缓冲RLT和250μL的绝对乙醇。通过移液彻底混合。 将每种混合物的 700 μL 转移到带有 2 mL 收集管的迷你旋转柱上。在4°C时以7，534 x g的离心30s将标记的cRNA收集到膜上。丢弃流通液体。 在 500 μL 的缓冲 RPE 中清洗每个样品。与上一步一样，离心并丢弃流速。重复此步骤一次，然后转到下一步。 将迷你旋转柱传输到新的收集管中。如步骤 3.3 中一样，通过离心干燥样品。 将迷你旋转柱转移到套件随附的无核酸 1.5 mL 微熔管中。通过直接将30μL的无核酸酶（在55°C预热）直接加入膜过滤器，将每个标记的cRNA样品贴上标签。通过在55°C热块中孵育60s，增强洗脱。 在室温下以7，535 x g的30 s离心收集标记的cRNA。丢弃旋转柱并关闭每个微熔管。立即将每个管放在冰上。可选停止点：样品在洗脱后可储存在-80°C。 使用微阵列功能用纳米滴量化cRNA。将样品设置为RNA-40。获取以下值并在电子表格中记录：氰素3染料浓度（pmol/μL）、RNA吸收率（260 nm/280 nm）和cRNA浓度（ng/μL）。停止点：读取后立即将 cRNA 样品储存在 -80°C。 计算 cRNA 产量和特定活动，详见 Püffeld 等人 20192. 4. 微阵列混合和扫描 注：此步骤只需 3-4 小时，因此 24 个样品的杂交可以在午餐后开始。一个操作员可以舒适地运行多达 4 张幻灯片（32 个示例）。第二天早上分配给扫描和扫描微阵列幻灯片。然后，可以在第二天的下午执行其他跑步。重复此步骤，直到对所有样本进行混合和扫描。强烈建议使用无色无粉乳胶手套处理和处理幻灯片，以确保样品不会受到可能干扰微阵列分析的彩色颜料的污染。除了商业上可用的微阵列外，以下自定义阵列由我们集团设计，可从安捷伦订购：大麦（霍迪姆莫勒尔）订购代码028827，大米054269（OryzasativaOryzasativa subs.Japonica），054270（奥里萨萨蒂瓦子子，印度）和小麦048923（三聚三聚三指）。 Japonica 使用基因表达混合工具包执行微阵列杂交（参见材料表）。根据制造商的规格2准备10倍的拦截剂。将 10x 阻滞剂报价到 200 μL 份中，并储存在 -20 °C，直到使用。每个等号足以进行多达 40 次杂交，并且稳定长达 2 个月。 在分配微阵列杂交的当天，在冰上解冻一个200μL的10倍阻塞剂。此外，将杂交炉预热至65°C，并将热块预热至60°C，用于cRNA破碎期间。 按照制造商2所述，为每个示例准备碎片混合。在我们的实验室中，我们经常使用 600 ng 线性放大的 Cy3 标记的 cRNA 在 8 包微阵列中进行杂交。在这种情况下，下面的列表总结了每个示例碎片混合的组件：600 ng 线性放大 cRNA，氰化物 3 标记• 5 μL 的 10x 阻滞剂使用无核酸水将体积调整至 24 μL• 1 μL 的 25x 碎片缓冲器• 总体积碎片混合的 25 μL 使用涡旋混合器轻轻混合样品。使用微离心机短暂旋转所有样品。 孵化60°C热块中的所有样品整整30分钟。立即冷却冰上每根管子一分钟，然后迅速进入下一步。 要完全停止碎片反应，向每个管添加 2 倍 GEx 杂交缓冲液 HI-RPM。通过上下移液轻轻混合，非常小心，在混合过程中不要引入任何气泡。我们经常使用25μL的混合缓冲器来阻止8包微阵列格式的碎片反应。 在环境室温下，在 15，750 x g下，将所有管离心 1 分钟。快速将所有管放在冰上，并尽可能快地装载每个样品。 在离开实验室进行 17 h 夜间孵育之前，请准备视频中详述的杂交组件2。 关键步骤：转移每个混合组合，并在每个垫片井的中心缓慢分配，观察在点胶过程中不要引入任何气泡。对于 8 包微阵列格式，我们经常使用 44 μL 的混合混合组合。还将 44 μL 的 1x 杂交缓冲液放置在任何未使用的井中。 立即将方向正确的微阵列滑块放在垫片滑块顶部。这需要非常小心，以免溢出任何液体。紧紧关闭混合组件并旋转以检查是否引入永久气泡。所有气泡都应在垫片滑道内移动。 将混合室组件放入混合式烤箱旋转器中。如果使用 2x GEx 混合缓冲器，则将旋转速度设置为 10 rpm，并在 65 °C 下混合，正好 17 小时。 使用基因表达洗涤缓冲套件清洗混合微阵列（参见材料表）。根据制造商的说明2准备基因表达洗涤缓冲区1和2。在两个缓冲器中加入 2 mL 的 10% Triton X-102（纯可选但强烈建议降低微阵列洗涤伪影的发生率）2。 准备三个洗涤室组件，如上一出版物2中详细说明的那样。下面列出了每个洗涤室的详细信息（表 1）。 在 1 L 试剂瓶中提供 500 mL 的洗涤缓冲液 1，并在环境室温下离开。准备一个额外的1升试剂瓶和标签与”洗涤缓冲器1重复使用”，以保存洗涤缓冲液从第一个腔室。此外，在试剂瓶中分值500 mL的洗涤缓冲液2，并在37°C水浴中孵育过夜。注：在未准备步骤 4.9 到 4.11 的情况下，请勿离开实验室。第二天洗涤步骤是必须的。 第二天，按照表2中详细说明的准备洗涤缓冲器。将每道菜填充到相应缓冲区的四分之三。每个洗涤缓冲器适用于多达 4-5 张幻灯片。 经过整整17小时的杂交后，获得一个杂交室，并在实验室的长凳上拆解无绒纸，如上一出版物2中详述的那样。 关键步骤：将微阵列三明治转移到第 1 道菜。确保微阵列条码朝上倾斜位置，并避免将整个幻灯片浸入缓冲区中。从两端处理每个微阵列幻灯片，避免接触幻灯片的活动侧。 使用钳子2分隔两个玻璃幻灯片。让垫片轻轻滑入 Dish 1 的底部，同时确保将微阵列滑块牢固地固定在下一步。 关键步骤：缓慢地抬起微阵列侧向滑动，并立即传输到 Dish 2 中的微阵列机架中，如上一出版物2中所述。微阵列幻灯片对空气的暴露程度极低，这一点至关重要。 重复步骤 4.13 和 4.14，直到机架中包含八张幻灯片。沿机架均匀分布微阵列幻灯片。此步骤可以由一个操作员在无人协助的情况下完成，最多只能进行 4 张幻灯片。将机架支架连接，并将整个 Dish 2 设置转移到第一个磁性搅拌器上。轻轻搅拌 1 分钟。 搅拌 1 分钟（步骤 4.14），从迷你 37 °C 培养箱转移第 3 道菜，放在第二个磁性搅拌器顶部。轻轻地将洗涤缓冲液 2（从 37 °C 水浴）放在第 3 道菜上。浇注时避免气泡形成。 搅拌1分钟后（步骤4.14），轻轻缓慢地将滑架从第 2 盘提起，然后转移到第 3 盘。拆下机架支架，搅拌正好 1 分钟。 从第 3 盘缓慢轻轻抬起滑架。一定要避免形成缓冲液滴2。轻轻触摸无绒纸，使每个幻灯片的两侧干燥。将每个污点干燥的幻灯片放在幻灯片框中，重复步骤 4.16，直到所有微阵列幻灯片都放在幻灯片框中。干燥约 15 分钟。可选停止点 将每个微阵列幻灯片放在幻灯片支架中，确保条形码朝上。注：微阵列室内的臭氧水平应为50ppb（100微克/米3）或更少。这纯粹是可选的，但强烈建议：使用臭氧屏障滑动盖，以避免氰化物的臭氧降解。 将组装的滑架放入扫描旋转木马中。根据条形码编号按顺序加载样品。使用微阵列扫描仪立即扫描幻灯片（参见材料表），如上一出版物2中详细说明。 运行后，将数据置于特征提取和 QC 验证中，如上一出版物2中详细说明的那样。