Viene presentato un metodo per la profilazione trascrittoma dei cereali. La profilazione dell’espressione genica basata su microarray inizia con l’isolamento dell’RNA totale di alta qualità dai cereali e continua con la generazione di cDNA. Dopo l’etichettatura cRNA e l’ibridazione dei microarray, vengono fornite raccomandazioni per il rilevamento del segnale e il controllo della qualità.
La caratterizzazione dell’espressione genica dipende dalla qualità dell’RNA. Nel germinare, sviluppare e maturi semi di cereali, l’estrazione di RNA di alta qualità è spesso ostacolata da un alto amido e contenuto di zucchero. Questi composti possono ridurre sia la resa che la qualità dell’RNA totale estratto. Il deterioramento della quantità e della qualità dell’RNA totale può successivamente avere un impatto significativo sulle analisi trascrittomiche a valle, che potrebbero non riflettere accuratamente la variazione spaziale e/o temporale nel profilo di espressione genica dei campioni testati. In questo protocollo, descriviamo un metodo ottimizzato per l’estrazione dell’RNA totale con quantità e qualità sufficienti da utilizzare per l’analisi del trascrittoma intero dei cereali. Il metodo descritto è adatto per diverse applicazioni a valle utilizzate per la profilazione trascrittomica dello sviluppo, della germinizzazione e dei semi di cereali maturi. Viene illustrato il metodo di profilazione del trascrittoma utilizzando una piattaforma di microarray. Questo metodo è specificamente progettato per la profilazione dell’espressione genica dei cereali con sequenze genomiche descritte. Viene descritta la procedura dettagliata dalla movimentazione di microarray al controllo di qualità finale. Ciò include la sintesi del cDNA, l’etichettatura cRNA, l’ibridazione dei microarray, la scansione delle diapositive, l’estrazione delle funzionalità e la convalida della qualità dei dati. I dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per caratterizzare il trascrittoma dei cereali durante la germinazione, in varie fasi dello sviluppo del grano o in diverse condizioni di stress biotico o abiotico. I risultati qui presentati esemplificano i dati di trascrittomi di alta qualità suscettibili di analisi bioinformatica a valle, come la determinazione dei geni espressi in modo differenziale (DEG), la caratterizzazione delle reti di regolazione genica e lo studio di associazione a livello di trascrittome (TWAS).
Il trascrittoma rappresenta l’insieme completo di trascrizioni dell’acido ribonucleico (RNA) espresse dal genoma di un organismo in un dato momento e in particolari condizioni ambientali e di crescita. Ogni cellula ha il suo trascrittoma individuale, che riflette il suo attuale stato fisiologico e metabolico. Una raccolta di cellule derivate da un tessuto o un organo simile viene utilizzata in un tipico studio del trascrittoma, ma la trascrittomica a cella singola e risolta nello spazio sta diventando popolare1. Le analisi trascrittomiche iniziano con l’estrazione dell’RNA totale da un tessuto selezionato in un determinato momento e in condizioni di crescita definite. A tale scopo, raccomandiamo l’uso di un metodo appena sviluppato per l’estrazione dell’RNA totale da campioni ad alto contenuto di amido o di zucchero, come i semi di cereali2. Il confronto dei trascrittomi tra diversi campioni determina l’identificazione di molecole di RNA con abbondanza diversa. Queste molecole di RNA sono considerate come geni espressi in modo differenziale (DEG). L’abbondanza di trascrizioni derivate da specifici geni marcatori può quindi essere utilizzata per stimare lo stato di sviluppo o determinare la risposta di un organismo alle fluttuazioni ambientali. I geni senza cambiamenti rilevabili nella loro abbondanza di trascrizioni nei punti temporali di sviluppo studiati sono spesso usati come geni di riferimento o di pulizia.
L’RNA viene tipicamente rilevato e quantificato con vari metodi, come il blotting del nord e la reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ma gli attuali metodi di transcriptomica ad alto rendimento si basano pesantemente sull’ibridazione dell’acido nucleico utilizzando la tecnologia microarray e il sequenziamento dell’RNA (RNA-Seq). RNA-Seq è molto popolare al momento perché fornisce diversi vantaggi per applicazioni trascrittomiche ad alta velocità effettiva come esaminato altrove3,4. Anche se una tecnologia più vecchia, la profilazione dell’espressione genica con chip di microarray è ancora ampiamente utilizzata perché è una tecnologia più consolidata, che richiede meno background in bioinformatica. Rispetto all’RNA-Seq, i set di dati generati dagli esperimenti di microarray sono più piccoli e più facili da analizzare. Inoltre, è più conveniente, soprattutto se si tratta di grandi numeri di campione. Nel nostro laboratorio, utilizziamo regolarmente analisi trascrittomiche utilizzando la tecnologia microarray per determinare il ruolo dei centri normativi centrali che governano le reti molecolari e i percorsi coinvolti nella crescita, nello sviluppo e nel metabolismo dei cereali5,6,7,8,9. Lo usiamo regolarmente anche per condurre studi di profilazione dell’espressione genica a livello di genoma per ottenere una comprensione meccanicistica della risposta dei cereali alle sollecitazioni abiotiche10, così come nella conduzione dell’associazione trascrittoma (TWAS) e nella mappatura delle collegamenti per identificare i geni responsabili della qualità dei cereali e della nutrizione11,12. Altri gruppi hanno anche utilizzato la tecnologia microarray nel fornire atlante di espressione genica specifica dello sviluppo in orzo13, riso14,15,16,sorgo17e grano18.
Lo scopo di questa pubblicazione è quello di fornire una breve sintesi testuale e una descrizione visiva dettagliata del metodo che attualmente impieghiamo nel nostro laboratorio per la profilazione trascrittomica dei cereali utilizzando una piattaforma di microarray Agilent. Si prega di notare che altre piattaforme microarray sono disponibili, ma non saranno coperti in questo metodo. Iniziamo il protocollo presentando una descrizione dettagliata dell’estrazione dell’RNA dallo sviluppo o dalla germinamento di semi di cereali. Sulla base della nostra esperienza, ottenere un trascrittoma di alta qualità e ad alta quantità suscettibile di analisi trascrittomica a valle è spesso il collo di bottiglia quando si utilizzano tessuti di semi di cereali. Abbiamo provato diversi kit di estrazione dell’RNA disponibili in commercio, ma nessuno ha fornito risultati soddisfacenti. Quindi, abbiamo sviluppato un protocollo di estrazione chimica per ottenere un estratto di RNA grezzo che viene poi sottoposto alla purificazione della colonna utilizzando un kit disponibile in commercio. Utilizzando questo metodo, otteniamo regolarmente e riproducibilmente RNA2 di alta qualità (Figura 1), che può essere utilizzato per diverse applicazioni a valle per generare un profilo di trascrittoma.
Il metodo descritto fornisce risultati altamente riproducibili per estratti di RNA ad alto rendimento e di alta qualità (Figura 1). Sulla base della nostra esperienza, raccomandiamo tre repliche biologiche per un genotipo, stadio o condizione per l’analisi. Per essere in grado di rilevare differenze statisticamente significative, è necessario considerare l’abbondanza generale di mRNA. Si prega di notare, tuttavia, che una quantità iniziale di 200 campioni di tessuto mg è necessaria in triplicati per la fase di estrazione dell’RNA. Quindi, per gli esperimenti che hanno una quantità limitata di campioni come materiali vegetali geneticamente modificati, questo metodo potrebbe non essere appropriato.
Durante l’ibridazione microarray, i seguenti passaggi sono i più critici: (1) caricare i campioni sul vetrino della guarnizione (passaggio 4.7) e (2) lavare gli array dopo l’ibridazione (passaggi 4.13 e 4.14). Il caricamento del campione deve essere fatto con molta attenzione per evitare la formazione di bolle e la fuoriuscita di liquidi. È necessario prestare attenzione quando si mette il vetrino microarray sul vetrino della guarnizione contenente i campioni caricati: il lato DNA (con sonde maculate) deve essere rivolto verso il basso per consentire l’ibridazione. Per lavare i microarray, la seconda fase di lavaggio è particolarmente critica: in questo caso, la rimozione dei vetrini dal buffer di lavaggio 2 deve essere eseguita molto lentamente (10 s) per evitare artefatti tamponanti sui vetrini, che possono interferire con l’acquisizione e l’analisi dei dati.
Per ricevere i risultati dell’esperimento di ibridazione ammissibili all’analisi bioinformatica a valle, si dovrebbero seguire alcuni criteri importanti. Il rapporto QC, generato dopo le prestazioni del protocollo precedente, fornisce una buona idea di ciò che dovrebbe essere migliorato e quali dati sono in una condizione utilizzabile (Figura 3). Le prime informazioni ricevute sono la griglia visualizzata (Figura 2). Qui, si può vedere direttamente se tutte le aree per la lettura a fluorescenza sono correttamente allineate. Se c’è uno spostamento rilevabile visivamente, questo influenzerà tutti gli altri valori (Sfondo, intensità del segnale, ecc.) e la lettura di questo chip non può essere utilizzata. Nella panoramica (Distribuzione spaziale di tutti gli outlier), si può facilmente individuare qualsiasi contaminazione (ad esempio, polvere o capelli), che ha influenzato il risultato. Lo sporco può essere rimosso soffiando dolcemente e riscansione del chip. L’istogramma della trama del segnale come indicato in precedenza dovrebbe risultare in un’ampia curva a forma di Gauss, con solo alier minori (Figura 2). A seconda del tessuto analizzato (Figura 1), questa curva può apparire diversa e può apparire per avere due picchi, o un picco predominante con una spalla. Ciò non influenzerà la qualità dei dati. Solo un forte picco spostato, o segnali elevati sui bordi indicano problemi, come “mostri verdi” (intensità di fluorescenza troppo elevate), che non possono essere rimossi con il lavaggio e devono essere segnalati al produttore del chip. Inoltre, il “grafico di distribuzione spaziale per segnali mediani” dovrebbe variare intorno a un valore comune. Questo dovrebbe essere compreso tra 40 e 100, a seconda dell’intensità generale del chip analizzato. Un altro importante controllo di qualità è la valutazione del picco di dati: il grafico del log per il picco di segnali dovrebbe risultare in una linea lineare e regolare. Infine, la tabella delle “metriche di valutazione” offre una visione buona e affidabile dei risultati ricevuti. Qui il produttore fornisce una gamma di valori che possono essere classificati come Eccellente, Buono e Valutare (Figura 3). Secondo la nostra esperienza, alcuni dei valori non possono sempre essere applicati per tutti i chip. Per i chip personalizzati di riso, il “valore nonControl” era spesso fuori portata, ma non influisce in modo significativo sull’ulteriore elaborazione dei dati. Inoltre, l’intervallo per “NegControl” potrebbe essere esteso, in base al tessuto, all’organismo e all’uscita generale del Chip a <80. L'intervallo di valutazione per il valore E1 med CV potrebbe essere esteso a <9, anziché a <8 in base alla nostra esperienza. A seguito di ciò, è possibile una corretta valutazione di tutti i dati letti dal chip. In generale, si dovrebbe sempre tenere a mente che le repliche biologiche indipendenti danno sempre il risultato più affidabile.
Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi sta nel fatto che rappresenta un metodo economico e ad alta velocità effettiva per la profilazione trascrizionale. Inoltre, la pipeline di analisi dei dati a valle è più facile e più consolidata. Nonostante i vantaggi, ci sono alcune limitazioni di questa tecnica, come il numero di geni che possono essere analizzati. Il microarray può solo facilitare l’analisi dei geni precedentemente avvistati sonde sull’array. Pertanto, questa tecnica è applicabile solo alle specie vegetali con genomi sequenziati e geni completamente annotati. Immaginiamo che la trascrittomica basata su microarray continuerà ad essere molto utile e rilevante non solo per la profilazione dell’espressione genica, ma anche per altre pipeline bioinformatiche a valle, come l’analisi della rete di regolazione genica e lo studio di associazione a livello di trascrittoma.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto nell’area tematica CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, e I’N (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Germania. Ringraziamo Mandy Pàffeld per la sua eccellente assistenza tecnica e la dott.ssa Isabel Maria Mora-Ramirez per la condivisione di informazioni ed esperienze con il chip di grano. Ringraziamo la Dott.ssa Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Germania) per i commenti e la lettura critica del manoscritto.
ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |