Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

Gram-negatif bakteriler periplazmik alan ve peptidoglikan hücre duvarı¹ile ayrılan iki membran üretirler. İç membran (IM) sitosol kapsar ve fosfolipidlerin simetrik bir çift katmanlı olduğunu. Peptidoglycan turgor basıncına karşı korur ve bir hücre şekli ile bakteri sağlar, ve dış membranbağlı (OM) lipoproteinler tarafından^2,3. OM periplazmayı çevreler ve ağırlıklı olarak asimetriktir. İç broşür fosfolipidler oluşur ve dış broşür lipooligosaccharides olarak bilinen glikolipidler oluşur (LOS) veya lipopolysaccharides (LPS)^4,5. Dış broşürdeki LOS/LPS moleküllerinin lipid asimetrisi ve biyokimyası, bakteriyi kendi ortamındaki tehlikelere karşı koruyan hücre yüzeyine bariyer özellikleri verir^6,7.

LPS molekülleri üç bileşenden oluşur: lipid A disakkarolipid, çekirdek oligosakkarit, ve O-polisakkarit veya O-antijen. Lipid A, çoğalan bir asilate disakkarolipidtir. Core-oligosakkaritler kaba LPS veya R-LPS olarak bilinen 10-15 şekerden oluşur. Çekirdek iç bölgeye ayrılmıştır, oluşan 2-keto-3-deoksi-D-manno-octulosonic asit (kdo) ve bir veya daha fazla heptozkoz kalıntısı, ve genellikle heksoslar oluşan bir dış bölge (glikoz veya galaktoz) ve heptozlar, veya asetama şekerler⁵. Dış çekirdek bölgesi bileşenleri ve yapısında iç çekirdekten daha değişkendir. Salmonella spp., sadece bir çekirdek yapısı açıklanmıştır; ancak, Escherichia coli beş farklı çekirdek yapıları (K-12, R1, R2, R3 ve R4)⁸belirlenmiştir. Bu işlemde kullandığımız E. coli K-12 DH5α, r-LPS⁹üretimine neden olan bir mutasyon taşır. R-LPS molekülleri O-antijen moiety eksikliği ve LOS molekülleri benzer bir molekül ağırlığına sahip.

R-LPS’ye O-antijen eklenmesi bu molekülü yumuşak LPS veya S-LPS’ye dönüştürür. O-antijenler kısa 3-4 karbonhidrat alt birimlerinden üretilmiştir ve¹⁰zincir uzunlukları değişen birden fazla yöntem oluşur. Bazı LPS üreten bakteriler, Salmonella enterica serovar Typhimurium gibi (S. Typhimurium), kendi yüzeyinde LPS moleküllerinin trimodal dağılımını görüntülemek^10,11. Çok uzun zincir O-antijenler yüz alt birim içerebilir ve yüz kilodalton üzerinde ağırlığında. O-antijenler antibiyotiklere direnmek, bakteriyofajlar tarafından predation kaçınmak için gerekli olan bakteri yüzey özellikleri sağlar, ve hastalığa neden.

Campylobactertürleri , Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria ve diğerleri kendi yüzeyinde LPS molekülleri yerine LOS molekülleri oluşturmak¹². LOS molekülleri lipid A ve çekirdek oligosakkaritler oluşur ama O-antijen eksikliği. Gram-negatif bakterilerin Bu tür yüzey özellikleri¹²değiştirmek için ek şeker ler ve şeker kombinasyonları ile çekirdek oligosakkaritler değiştirmek. Hem LOS hem de LPS üreten mikroplar lipid A ve katyonik moieties⁷ile çekirdek molekülleri fosfatlar türemiş . Bu eklemeler fosfoetanolamin içerir, galaktosamin ve aminoarabinose ikameler, anyonik yüzey yükü nötralize ederek işlev ve bu nedenle katyonik antimikrobiyal peptidler karşı koruma. Gram-negatif bakteriler de şekerdeğişken olmayan stoiyometrik ikame ile çekirdek oligosakkarit yapısını değiştirmek, ya da ekstra kdo molekülleri, ve lipid-A disaccharolipidler üzerinde asil zincirlerin sayısını değiştirmek⁷.

Yeteneği Gram-negatif bakterilerin OM im izole etmek için antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hücre zarfının rolünü anlamak için etkili olmuştur^11,12. Bu yaklaşımın türevleri, OM için protein, fosfolipid ve glikolipid bileşenlerinin montaj, bakım ve yeniden biçimlendirilmesi mekanizmalarını saptamak için kullanılmıştır.

Laboratuvarımız, çeşitli Gram-negatif türlerde protein aracılı lipid regülasyonu ve lipid fonksiyonunu incelemek için rutin olarak bakteriyel lipidomik analizler yapar. Protokolde kullanılan hacimler ince tabaka kromatografisi ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi^13,14ile radyoetiketli olmayan fosfolipidleri analiz etmek için bu işlemin rutin kullanımını yansıtır.

Protokol, Gram-negatif bakterilerin soğutulmuş süspansiyonunun yüksek ozroz çözeltisine maruz kalmaları ve OM’yi altta yatan peptidoglikan tabakasından ayrıştırmak için lisozyme ekleyerek başlar (Şekil 1)¹². EDTA daha sonra lizozim penetrasyon kolaylaştırmak için eklenir, divalent katyon sekestrasyon komşu LOS / LPS molekülleri arasındaki lateral elektrostatik köprü etkileşimleri bozar beri¹⁵. Bizimkinin uyarlandığı orijinal protokol, plazma zarı ve sitosoldan oluşan gram-negatif bakteri hücresi formu olan sferoplastların oluşumunu gerektiriyordu, ancak peptidoglikan tabakası ve OM’den yoksun. Spheroplastların uyarlanmış yöntemle üretilmeleri mümkündür; ancak, teknik, başarı için kendi oluşumuna güvenmez veya niyet etmez. Bunun yerine, lysozyme-EDTA tedavi edilen bakteriler santrifüj ile hızla hasat edilir ve basınçlı lysis önce daha az konsantrasyon bir sakaroz çözeltisi yeniden askıya alınır. Spheroplastlar oluşturarak serbest bırakılmış olabilecek OM’ler teorik olarak tedavi edilen hücrelerin süpernatants hasat edilmelidir, ancak bu yaklaşım burada ayrıntılı değildir. Sonuçta, tedavi hücreleri membran ayırma prosedürü¹⁶verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırır konvansiyonel homojenizasyon ve lysis, tabi tutulur.

Lysis’ten sonra, toplam membranlar ultrasantrifüj ile toplanır ve IM’ler ve OM’leri fraksiyonetmek için sürekli sakaroz yoğunluğu gradyan uygulamasına uygulanır. Klasik yaklaşım en az beş farklı sakaroz çözeltisi^11,,12oluşur daha sürekli bir degrade kullanır. Protokolümüzdeki kesintili degrade üç sakaroz çözeltisi oluşur ve iki kat iki farklı kesirler¹⁷bölümlür. Gram-negatif bakterilerin OM’leri içindeki LOS ve LPS molekülleri zarfı üst kahverengi düşük yoğunluklu BIR IM fraksiyonuna ve daha düşük beyaz yüksek yoğunluklu OM fraksiyonuna bölmeye iter(Şekil 1 ve Şekil 2).

Acinetobacter baumannii kendi OM LOS molekülleri üretmek ve ayırmak zor bir hücre zarfı dik önemli multidrug dirençli insan patojenler vardır^18,19. Son çalışmalar, burada sunduğumuz protokolün bir türemiş bu organizmaların iki katmanlı²⁰bölünmesi için kullanılabilir düşündürmektedir. Bu nedenle protokolümüzü A. baumannii 17978’de test ettik. Başlangıçta, prosedür yetersizdi. Ancak orta yoğunluk çözeltisinin sakaroz konsantrasyonu ve büyük ölçüde geliştirilmiş ayırma(Şekil 2)olarak değiştirildi. A. baumannii,yabani tip S. için ayrışmayı doğrulamak için NADH dehidrogenaz tayini ve LOS/LPS ekstraksiyon ve algılama prosedürü kullanılmıştır. Tiphimurium ve iki O-antijen eksikliği enterobakteriyel genotip; yani, galE-mutant S. Tiphimurium ve laboratuvar suşu, E. coli DH5α (Şekil 3 ve Şekil 4).

Bu çalışmanın amacı, Gram-negatif bakterilerin zarlarını tekrarlı bir şekilde izole etmek için düzenli bir yaklaşım sağlamaktır. Protokol bu mikroplar için membran ilişkili moleküllerin birçok türde çalışma için kullanılabilir.