我们描述了一种将鼠源胰腺腺腺腺腺腺癌细胞系直接植入原生肿瘤部位的超声引导植入方案。与手术正交植入相比,这种方法在注射后2-4周内通过超声波扫描检测胰腺肿瘤,显著降低了围肠壁上肿瘤细胞播种的比例。
最近,黑色素瘤和肺腺癌免疫检查点封锁的成功刺激了免疫肿瘤学领域,并揭示了当前治疗的局限性,因为大多数患者对免疫治疗没有反应。开发准确的临床前模型,以快速识别新颖有效的治疗组合,对于满足这一未满足的临床需求至关重要。胰腺导管腺癌(PDA)是免疫检查点阻断耐药肿瘤的规范例子,只有2%的患者对免疫治疗有反应。基因工程克拉斯G12D+/-;Trp53R172H+/-;PDA的Pdx-1 Cre(KPC)小鼠模型重述人类疾病,是评估临床前免疫治疗抗药性治疗的宝贵工具,但肿瘤发病时间变化很大。PDA的外科正交肿瘤植入模型保持KPC组织特异性肿瘤微环境(TME)的免疫生物学特征,但需要耗时的手术,并引入异常炎症。在这里,我们使用超声波引导的正交肿瘤植入模型(UG-OTIM)将非侵入性PdPc衍生的PDA细胞系直接注射到小鼠胰腺中。UG-OTIM肿瘤生长在内源性组织位点,忠实地重述PDA TME的组织特征,并在注射后四周内达到注册大小的肿瘤进行临床前研究,并在围肠壁上进行最少的播种。此处描述的 UG-OTIM 系统是一种快速且可重复的肿瘤模型,可用于对小鼠 PDA TME 中的新型治疗组合进行高通量分析。
胰腺导管腺癌(PDA)是一种众所周知的侵略性疾病,对目前的治疗是难治的,5年生存率为9%。PDA最近超过乳腺癌,成为美国癌症相关死亡的第三大原因,预计到2030年将成为第二大病因(仅次于肺癌)。免疫学”冷”PDA肿瘤微环境(TME)的一些特征-包括免疫抑制骨髓细胞群的高渗透3,4,5,6,7,致密基质沉积8,9,10,11,以及缺乏T细胞5,12,13-贡献PDA14免疫疗法的失败。为此,使用临床相关动物模型是研究新药组合对体内免疫性感冒肿瘤疗效的重要工具。
基因工程克拉斯G12D+/-;Trp53R172H+/-;PDA的Pdx-1 Cre(KPC)小鼠模型忠实地概括了人类PDA的显著临床方面,包括疾病的分子驱动因素和组织病理学特征15。KPC肿瘤在完全免疫能力小鼠中自发发展,允许接受化疗方法,包括化疗16、17、免疫疗法18、19、20、21和在临床试验中给药前的频闪靶向治疗9、11、22。尽管KPC小鼠作为PDA的临床前模型有许多优势,但自然肿瘤发育的变数变化很大,因此其使用处于不利地位,因为肿瘤发病范围为4至40周(因此需要维持一个大型繁殖群)15。此外,KPC小鼠有多克隆原发性肿瘤23的潜力,并且动物健康迅速下降,随着疾病进展15,包括隐匿症和腹水在内的共病性增加。
自发KPC小鼠模型的一个替代方案是使用PDA24的正射体植入模型。将肿瘤细胞系直接手术植入原生组织部位是一种更具成本效益和可预测的方法,用于重述PDA的组织特异性肿瘤微环境(TME)。肿瘤植入允许向基因背交鼠5的克隆肿瘤细胞系注射,允许宿主小鼠进行额外的基因操作,这将非常耗时地繁殖到KPC小鼠模型。然而,胰腺肿瘤植入需要一个劳动密集型的外科手术,在腹壁24、25、26的缝合部位引入异常炎症,并且通常包括长时间的术后恢复27、28、29。
使用啮齿动物特异性传感器进行超声成像的技术进步可实时提供高分辨率图像。在围肠腔注射针运动的超声成像指导下,可以专门将肿瘤细胞植入胰腺,在无手术植入和相关炎症的情况下利用正交肿瘤注射的好处。这种方法,称为超声引导正交肿瘤植入模型(UG-OTIM)以前已经建立了在胰腺癌30的异种移植模型,以及其他几个癌症模型,包括尤因的肉瘤,神经母细胞瘤和膀胱癌31,32。
在这里,我们提供了一个详细的协议,用于在鼠胰腺中执行肿瘤细胞系的超声波引导注射。我们展示由此产生的肿瘤,重述KPC TME的组织学和免疫学特征,因此可用于研究新的治疗组合,包括免疫疗法,以迅速揭示最有前途的治疗方法移动推进临床试验。
我们在这里表明,使用高分辨率超声造影将鼠PDA细胞系直接植入自体组织部位是KPC和外科正交模型系统的可靠替代方案。UG-OTIM产生与生物相关的肿瘤,保留PDA的免疫病理特征,缩短肿瘤诊断和可靠的肿瘤生长动力学的时间框架。因此,超声波引导注射可以作为快速生产携带正位植入PDA肿瘤的小鼠的有用工具,允许在临床相关模型中研究治疗组合。
超声引导植入比临床前调查的标准模型有重要的改进。首先,通过直接将完全C57BL/6背交的PDA细胞植入小鼠胰腺中,消除了对KPC小鼠发育自发肿瘤的长时间监测。其次,与传统外科正交注射类似,UG-OTIM方法允许控制注射的细胞系,包括选择单克隆肿瘤细胞系和/或细胞系的体外操作,以及控制接收肿瘤细胞植入的宿主。第三,这种微创技术避免了生存手术的繁琐劳动,绕过了动物复杂的术后恢复期以及手术伤口愈合产生的炎症信号。最后,UG-OTIM肿瘤-类似于手术植入-重述在KPC小鼠中观察到的TME,包括低T细胞渗透和高巨噬细胞渗透。因此,UG-OTIM 模型保留了 KPC 肿瘤的关键特征,没有额外的并发症,从而延缓自发 KPC 模型中的治疗研究。
协议中的一些关键步骤是掌握该技术成功的关键。鼠超声成像方面的专业知识对于此过程至关重要,但成功将细胞植入胰腺所需的手动灵巧性是必须独立开发的一套技能。对于12小时光明/黑暗周期的小鼠,在动物身上禁食一夜,确保胃和肠被清除任何未消化的食物,这些食物可以通过超声波阻断胰腺、肾脏和脾脏的观察。此外,用于正交注射的每个细胞系应在进一步实验之前进行定子,以了解生长动力学并确定转移电位33。在注射过程中,使用钳子在注射部位捏合皮肤,造成皮肤和围肠壁轻轻穿刺所需的张力。手术的一个关键步骤是小心地引导针头进入胰腺,而不穿孔组织或刺穿离目标部位,如脾脏或肾脏。确认液体血球是正确组织中肿瘤细胞注射成功的最佳指标。注射后,针头应慢慢拔出,以免干扰液体。我们发现,使用DMEM或Trypan Blue的一系列试验性注射有助于掌握这种注射所需的精细运动技能。
在此过程的故障排除过程中,我们确定了影响协议成功的许多因素。在试验实验中,我们最常见的错误是在植入过程中穿孔肾脏,这在早期实验中更为频繁,表明经常练习这种技能可以提高熟练程度。此外,我们发现,通过超声和直接可视化在故障排除阶段在诊断阶段确认肿瘤细胞注射后存在液体血性血球,改进了成功的注射技术。如果在注射过程中没有超声波确认气泡的形成,可以在完全压压注射器以释放肿瘤细胞的剩余栓塞之前调整针头的位置。我们还观察到,注入过快的悬浮量导致肿瘤细胞溢出到围室或胰腺中液体胸腔崩溃。一般来说,这些动物继续发展胰腺肿瘤,除了n+7动物,没有显示肿瘤的证据4周后注射。这一结果仅在我们第一次尝试时报告(6/7只动物被注射了低酸量的肿瘤细胞)。有可疑的肿瘤细胞注射,或需要重新定位针头的小鼠,应密切监测胰腺外肿瘤的发展。
超声引导方法的首要限制是所需仪器的可用性以及与肿瘤植入相关的技术技能。该过程并非完全无菌,因为小鼠在超声波平台上不无菌地被注射,注射器和针头通过超声波凝胶。尽管自发起这些研究以来,在总共8个独立实验中,我们没有看到任何148只小鼠感染的证据,但在这个过程中,传染性病原体有可能通过注射针进入胰腺。因此,协议的许多方面(包括手套、超声波表面、冰盒)应喷洒消毒剂或70%乙醇,以减少对病原体的潜在接触。当前协议的一个附加限制是,在当前稀释时,使用4662细胞系缺乏转移。UG-OTIM系统中使用的每个细胞系都应针对所需的生长速率以及转移电位33进行定子。最后,我们目前的协议建立了在单细胞悬浮液中注射肿瘤细胞的技术。然而,可以添加细胞外基质基质,以潜在地加强肿瘤建立和防止肿瘤细胞泄漏(因为它用于手术植入模型27,30,31,32)。因此,UG-OTIM的许多局限性可以通过对正交注射中使用的细胞系进行适当测试来克服。
总之,UG-OTIM模型是将肿瘤细胞组织定向注射到鼠胰腺的精确方法。这种微创植入技术通过缩短手术时间、最大限度地减少手术后并发症和提高注射精度,对研究者和动物都有好处。UG-OTIM注射引起的肿瘤保留了自发性KPC肿瘤的免疫生物学特性,对肿瘤发病有可靠的时间,并且可重复肿瘤生长动力学。因此,UG-OTIM 模型可以以相对较高的通量方式用于在临床前环境中询问治疗组合,以揭示针对临床需求最大未满足的患者的新疗法。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢罗伯特·冯德海德博士和冯德海德实验室的所有成员,胰腺癌小鼠医院的所有成员,宾夕法尼亚大学胰腺癌研究中心的本·斯坦格博士和德沃拉·德尔曼有益的讨论。这项工作得到了帕克癌症免疫治疗研究员奖(KTB)和宾夕法尼亚大学胰腺癌研究中心(CC)的资助。
50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |