下流解析のための凍結げっ歯類の脳領域の収集

この研究は、アレンマウス脳アトラス¹などの参考文献を用いて、高品質の核酸またはタンパク質を抽出するための凍結脳領域の解剖をガイドとして示している。この技術では、脳はフラッシュ冷凍され、後で切断および解剖のために-80°Cで保存され、凍結状態で維持される。このプロセスは、研究者が1回のセッションで多数の脳を収穫し、後で複数の脳領域の正確なコレクションのためにそれらを解剖することを可能にする。

多くの場合、遺伝子やタンパク質発現に関する質問に答える際には、関心のある脳領域(ROI)の正確な収集が必要です。薬理学、電気生理学および光遺伝学は野生型または遺伝子組み換えげっ歯類に使用され、観察された行動を支える分子変化を解明するのに役立つ^{2,2、3、4、,4}トランスクリプトームおよびプロテオームの誘発変化の測定はこれらの知見を支持するためにしばしば使用される。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)、ウェスタンブロッティング、RNAseq 5、MAPSeq⁶およびHPLC⁵⁷などの技術は、堅牢で比較的低コストであり、多くの研究室が小さな脳領域内での分子変化を研究することを可能にする^{2、4、5、6。4,5,62}

^,脳領域^,,8,9,10,11,12から核酸やタンパク^8,9質を抽出して精製する方法はいくつかあります。¹⁰¹¹¹²多くの研究室は、収穫^時に氷の上で脳を冷やし、切断することによって脳領域を収穫します^9,13.このアプローチは、高品質の核酸およびタンパク質をもたらす可能性があるが、組織の微小環境内での分解がこれらの温度で起こり得るため、幾分時間制限がある。これは、一度に多数の動物やROIを解剖しようとするときに特に当てはまるかもしれません。サンプルを凍結しておくと、陰唇標的分子を維持するのに役立ち、比較的純粋なサンプルを収集するために、各セクションの両側のランドマークを慎重に比較する時間を研究者に提供します。レーザーキャプチャは、脳領域¹⁰からRNAまたはタンパク質分析のための組織を収集する別の方法です。この手順は、非常に小さく不規則な形状のROIを同定し、単離することができるという機械的解離よりも優れています。しかし、レーザー捕捉は高価な装置および試薬の使用によって制限され、時間がかかり、またサンプル分解の影響を受けやすい場合がある。

凍結組織のマイクロパンチ解剖は新しいものではありません。ミクロス・パルコヴィッツの初期の論文は、基本的なテクニックを詳細^14,15,15に詳述している。このプレゼンテーションは、効率を容易にし、必要な機器の費用を削減するためにいくつかの改善と、主に元の作業に従います。例えば、脳の切片は、クライオスタットではなく、凍結された脳ブロックで作られています。これにより、ROI サンプルの収集に必要なセクション数を削減する、より厚いセクションが生成されます。この方法はまた、絶縁箱内のドライアイスに座っている凍結ガラス板のサンプルを解剖する。これは、作業するベンチでサブ凍結段階を生成します。このように解剖されたセクションは操作が容易であり、研究者は目的のROI外の領域からの汚染を制限するために、各セクションの両側を参照と比較することができます。

このプロトコルの利点は、1)脳がプロセス全体を通して凍結状態に保たれ、タンパク質と核酸を保存するのに役立ち、研究者にROIを慎重に収穫する時間を与え、2)必要な試薬は安価であり、ほとんどの分子生物学研究室に見られることです。このプロセスでは、脳全体を脳のマトリックスで0.5~1.0mmに切り離し、氷で継続的に冷やされる凍ったガラス板の上に置きます。アレン・ブレイン・アトラス1または他の脳アトラス^16、17,17に見られるランドマークは、関心のある領域を識別するために使用され、冷たいパンチまたはメスのいずれかを使用して解剖されます。¹組織が解凍されることは決してないので、この方法で収穫された領域は、下流の分析のための高品質のRNAとタンパク質を提供します。