使用光子芯片的高通量总内反射荧光和直接随机光学重建显微镜

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）层的制备 准备 10：1 组合 Sylgard 184 单体和固化剂。 将混合物放入真空室，直到气泡消失。 将 1.7 克 PDMS 混合物倒入 3.5 英寸（直径）培养皿的中心。 将培养皿放在旋转外套机的真空夹头上。 在 900 rpm 转速下旋转培养皿 20 s，加速度为 75 rpm/s。 在50°C下将盘子固化至少2小时。 2. 样品制备 波导清洁 在去离子 （DI） 水中制备 100 mL 的 1% 稀释洗涤剂浓缩液 （材料表）。 使用晶圆钳将芯片放入玻璃培养皿中，并用洗涤剂溶液完全覆盖。 将培养皿放在 70°C 的热盘上 10 分钟。 当仍然在热板上时，用洁净室组织拭子擦拭表面。 从培养皿中取出芯片。用至少 100 mL 的 DI 水冲洗。 用至少100 mL的异丙醇冲洗，注意溶剂不会在表面上干燥，以防止蒸发污渍。 用至少 100 mL 的 DI 水冲洗。用氮气枪将芯片吹干。 室准备 在培养皿中制备一层150μm聚甲基硅氧烷（PDMS）。 使用手术刀从 PDMS 层切割 1.5 厘米 x 1.5 厘米框架。 用钳子将框架从培养皿中提起。将其平放在干净抛光的芯片上。该示例现已准备好进行细胞种子设定。 荧光贴标 制备以下化学品：磷酸盐缓冲盐水溶液、染料溶液、dSTORM成像缓冲液。 细胞播种后，从介质中取出芯片。 使用移液器从 PDMS 造型室外清除多余的液体。 用移液器从 PDMS 腔室中取出当前液体，同时添加约 60 μL 的清洁 PBS。注： 添加到造型室的金额必须根据造型室大小进行更改。小心不要从细胞表面去除所有介质。 用60μL的清洁PBS替换PBS，让它孵育1分钟。 重复上一步，让它孵育5分钟。 拆下 PBS 并将其替换为 60 μL 的染料溶液。让样品孵育约15分钟，使其免受光线照射。注：此步骤可能必须显著更改，具体取决于使用的荧光染料。我们使用细胞掩码深红色来标记这个实验的细胞膜 按照步骤 2.3.3-2.3.5 中的步骤，用 PBS 清洗样品。 取出 PBS 并同时将其替换为 40 μL 的成像缓冲液。注： 对于不同的荧光染料，有几个不同的成像缓冲液。 将盖玻片放在顶部，防止气泡在下方形成。轻轻按压成像室的盖玻片，以去除任何多余的介质。 使用移液器清除盖玻片外的任何多余介质。用水湿拭子清洁盖玻片外区域，以避免干燥浸渍介质残留物形成的晶体。 3. 成像程序 组件设置注：此版本的设置由三个主要组件组成：显微镜、耦合阶段和样品级。请参阅材料表。 使用带滤光片支架、白色光源、照相机和物镜的显微镜。 使用带光纤耦合激光器和耦合透镜的 3 轴压电耦合级。 使用带尖端和倾斜的单轴手动样品级和真空支架。 将耦合和样品级安装在 2 轴电动级上，以便进行样品平移。 波导耦合 将芯片放在真空夹头上，使耦合面朝向耦合目标。确保芯片距离耦合目标大约一个焦距。 打开真空泵。 将激光打开至 1 mW。粗略调整芯片高度，使光束击中其边缘。关闭激光。 打开白色光源。选择低放大倍率物镜（例如 10 倍）。将显微镜聚焦在波导上。 沿波导翻译显微镜，看它是否与光学路径完全对齐。将显微镜移到耦合边缘。 以 1 mW 或更少的速度打开激光。沿耦合边缘翻译显微镜以找到激光。将光束聚焦在芯片边缘上。 沿光路调整耦合级，减小激光束光斑大小，直到其消失。光束现在位于芯片表面的上方或下方。 调整耦合级高度，直到光束点重新出现并最大化。 重复上述两个步骤，直到激光形成聚焦点。 将焦点移动到感兴趣的波导。 将显微镜与边缘距离较短的距离平移，使聚焦的光束点不再可见。关闭白灯。 调整对比度。如果波导是引导的，则波导沿波导的散射光应清晰可见。 调整耦合级的轴，以最大化散射光强度。关闭激光。 打开白灯。如有必要，调整对比度。 导航到成像区域。 衍射有限成像 以所需的成像目标为焦点。把白灯关掉。 插入荧光滤光片，将激光功率调至 1 mW。 将相机曝光时间设置为约 100 毫秒。确保联轴器仍然经过优化。 找到成像感兴趣的区域。打开压电阶段循环以平均出模式。注：20 μm 扫描范围，步长大小为 50 nm，适用于大多数波导结构。 捕获至少 300 张图像。 使用虚拟堆栈将捕获的映像堆栈加载到斐济。在斐济的图像菜单中，选择”堆栈”和”z 项目”。 通过选择投影类型平均强度来计算 TIRF 图像。 d斯托姆成像 将激光打开到 1 mW，并将相机曝光时间设置为 30 毫秒。 调整对比度和焦点。 增加激光功率，直到看到闪烁。注： 这可能需要一段时间，具体取决于消逝的场强度。 放大样本的一小部分区域。 调整对比度。 捕获一些图像，以查看闪烁是否很好地分隔。 调整相机曝光时间，以获得最佳闪烁效果。注意：优化闪烁是一项复杂的任务，但有很多合适的文献是可用的12。 打开压电阶段循环。 根据闪烁密度，记录至少 30，000 帧的图像堆栈。 dSTORM 图像重建 打开斐济并加载dSTORM 堆栈作为虚拟映像。 如有必要，调整对比度。 使用矩形工具选择要重建的区域。 开放运行分析在雷雨13插件在斐济。 在雷雨中设置与设备对应的基本摄像机设置。其余默认参数通常令人满意。 开始重建。注： 对于整个视野，由于文件大小较大，数据可能需要分成子堆栈。 筛选重建软件提供的本地化列表以删除未特定的本地化。如有必要，苹果会额外修正漂移。