再建微小外科における虚血再灌流損傷の研究のための前臨床ラットモデル

すべての手続きは、ヘスス・ウソン低侵襲手術センターの倫理委員会とヨーロッパの法律に基づく地方政府の福祉ガイドラインに従って行われました。 1. 手術前および外科的準備 ハウスウィスターラットは、食べ物と水への無料アクセスで22〜25°Cのケージに290〜350グラムの重量を量ります。ストレス誘発の問題を防ぐために手術の前に1週間の順応。 ラットを麻酔誘導室に入れ、5分の酸素(0.5-1 L/min)を送り、気化器を使用して5%のセボフルランを送達して麻酔を誘発する。 麻酔が誘発されたら、ラットを部屋から取り出します。ラットに吸入フェイスマスクを置き、麻酔を維持するために2%セボフルランの流量を提供する。つま先のピンチに対する応答の欠如を確認します。 角膜の乾燥や損傷を防ぐために目の保護軟膏を使用してください。 全身麻酔下で動物を次のように監視する:直腸温度計(35.9~37.5°C)を設置し、粘膜の色を確認し、げっ歯類パルスオキシメータを配置してO2飽和度(>95%)を確認します。心拍数(250~450 bpm)。 低体温を避け、術後麻酔の回復を改善するために、熱サポート(電気加熱パッドまたは循環水毛布)を使用してください。 適切な水分補給を維持するために、温かい皮下生理食塩水の5 mLを注入する。 鎮痛薬と抗炎症薬(メロキシカム1mg/kg/日)と予防抗生物質(エンロフロキサシン7.5mg/kg/日)を処置前および術後5日間皮下に提供する。 動物の腹部と鼠径部を剃ります。 局所ポビドロン-ヨウ素を適用し、70%のエタノールを続けます。無菌のドレープで動物を覆う。 2. 無料のスキンフラップモデル手術 外科マーカーを使用して、腹部の中間線と6 cmの側面の1つに一致する3 cm x 6 cmのフラップを描きます。次に、腹部の中間線で6cmの皮膚切開を行い、6cm中線切開の上下部分に2つの垂直な3cm切開を行う。 設計された3 cm x 6 cmのスキンフラップの解剖を開始するには、はさみとAdson鉗子を使用して、皮膚の可動性のために(メスではなく)フラップを上げます。 頭蓋領域から大脳領域に向かってフラップをゆっくりと引き出し、解剖を助け、豊富な緩い結合組織に囲まれた上腹部のペディクルを特定します。 フラップペディクルに触れることなく、または容器の壁を損傷しないように、アドベンティティアをできるだけ少なく把握して解剖します。 8/0ナイロン縫合糸を使用して、近位の大腿骨血管、横円周大腿骨血管、およびサフェノス血管の合字によって閉塞します。それによって、フラップの灌流は大腿動脈によって提供され、表在性の大腸上腹部動脈を通って直接続き、静脈排液は表在性大腿骨上腹部静脈に向かって行われる。 血管ペディクルをクランプし、8時間虚血期間を開始するためにそれをカットします。手順の間に温度を維持するために電気毛布を使用する。温かい(25°C)0.9%生理沈水溶液の2つの5ml注射は皮下投与される。最初の管理は、手順の開始後 2 時間実行されます。および第2は、動物の適切な回復を得るための手順の終わりに。 ヘパリン化生理行き溶液(100 U/mL)を使用してフラップをパーフューズし、微小循環から停滞した血液を除去します。 10/0ナイロン縫合糸を使用して、マイクロサージカルなアナストモーゼを行います。 虚血の8時間後、微小血管クランプを取り外してフラップを再浸透させ、以下に説明するように血管のパテンシーを確認する。 3. 術中評価 静脈と動脈の手動口蓋検査(空および補充試験)を行う。これを行うには、2つの微小外科的鉗子を使用し、解剖学的に遠位に配置し、搾乳を行う。最初に解剖部位に最も近い鉗子を解放する。血管切除が空になった後も血流が続く場合、解剖は特許である。 通過時間超音波流量計とマイクロサージカルプローブを使用して血流を評価します。 流れプローブの適切なサイズを選択するために、ペディクル容器の直径を測定します。注:0.7 mmの流れの調査は0.4 mmから0.7 mmまで及ぶ容器を測定できる;1.0 mmの流れの調査は0.7 mmから1.0 mmまで及ぶ容器を測定できる;1.5 mmの流れの調査は1.0 mmから1.5 mmまで及ぶ容器を測定できる。 流れプローブの超音波検出ウィンドウ(リフレクターとトランスデューサの間)にターゲット容器を配置し、流量を定量化します。注:プローブを容器の平面に中立に保持し、張力や引っ張りを避けます。 すべてのバーがディスプレイ上で緑色であることを観察することにより、音響カップリングの品質を確認します。注:良好な音響カップリングを得ることが困難な場合は、超音波ゲルまたは生理食塩水溶液を局所的に使用してください。 良好なカップリングが達成され、容器が張力なしで音響窓に置かれたら、データを格納するためにディスプレイの録音ボタンをクリックします。注:信頼性の高い正しい測定値を得るためには、波形パターンが常に繰り返し可能であることを確認します。 完了したら、ポリグリコール酸(PGA)4-0吸収性編組縫合糸(16mm 3/8三角形針)を使用して皮膚を閉じます。縫合糸の一部が術後にラットによって噛まれた場合、強度と組織位置を維持するために、単純な中断パターンを使用します。 レーザースペックルコントラスト解析(LASCA)を使用してフラップの微小循環を評価します。 各動物と研究の各フォローアップのための新しい記録を作成します。この場合は、[ファイル]/[新しいレコーディング]をクリックします。新しいウィンドウが開き、セットアップ パネルが表示されます。次に、プロジェクト名、件名、オペレータ、およびレコーディング名の情報を編集します。 再現性を最大限に高めるには、作業距離、測定領域、ポイント密度、フレームレート、周囲光条件のパラメータを標準化します。 組織に対してレーザーを動かして、作業距離を調整します。目的の組織に向かってレーザーヘッドを拡大または縮小します。測定値を確認するには、[イメージの設定]をクリックします。ここでは、12.0 cmに設定します。 [イメージの設定]で目的の幅と高さを入力して、測定領域を標準化します。設計されたフラップは3 cm x 6 cmを測定する。この測定では、幅 4.0 cm、高さ 7.0 cm を選択して余分なスペースを設定します。 [イメージ設定]で[ポイント密度]を高く設定します。高、中、低の 3 つのオプションがあります。 イメージキャプチャ設定で、録画のフレームレート(10 イメージ/s)と録画の継続時間(1分)を選択します。注:手術室で同じ周囲光状態を有し、評価を操作または実行している間。 [録音]ボタンをクリックして記録を開始します。セットアップパネルは録音パネルに置き換えられます。データは自動的に保存されます。さらに比較を有効にするには、手順中にスナップショットを作成します。注:灌流縮尺は、視覚化を改善するために変更することができます([ ツール |フィルタとカラースケール |灌流スケール |手動 0 ~ 150)が、測定された灌流値は影響を受けません。記録の前後に、異なる対象領域(ROI)を作成して、それらの中の灌流を測定することができます。ここでは、練習フラップの面積(3cm×6cm)のみを評価した。 生存領域と壊死領域を測定するには、ImageJ ソフトウェアを使用します。 フラップの側面に定規を見つけ、フラップ生存領域のマクロ的な測定のためのコントロール写真を撮ります。 画像を評価するには、ImageJ ユーザー インターフェイスを開きます。[ファイル]をクリックし、測定するイメージを開きます。 ツールボックスで[直線]を選択し、ルーラーの 1 cm 上に直線を描画します。[分析] |[スケール] を設定し、テキスト ボックスに 1 cm の値を既知の距離で表示します。 ポリゴン選択ツールをクリックし、フラップの上にポリゴン ラインを描画して、実行可能な領域を計算します。最終的には、[分析|面積の値を取得する測定。 手術領域の自己変異を防ぐために、ハウジングの前に動物に術後ドレッシングを置きます。手順の後、動物は、温度制御(22°C〜25°C)の部屋で、個別にケージに収容されます。 4. 術後評価と組織サンプリング このプロトコルで前述したのと同じ手順(ステップ1.2および1.3)に従って、フラップ評価および組織サンプリングのために術後7日でラットを麻酔する。つま先のピンチに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。 フラップ生存領域と壊死領域のマクロ的測定を可能にするために手術領域を撮影します。プロトコルで前に説明した術中評価と同じ手順に従って、術後のマクロスコピック測定を行います (ステップ 3.5)。注:ポリゴン選択ツールを使用する際には、実行可能領域を区切るフラップ上に線を描画します(cm2で測定)。生存面積のパーセンテージは、(総フラップ面積の生存面積/cm2のcm2)×100として算出することができる。 LASCA技術(ステップ3.4)を使用してフラップの微小循環を評価し、灌流差を可視化および定量化する マクロ分析の後、4/0縫合糸を取り除き、フラップを上昇させ、通過時間超音波を使用して血管ペディクル血流を再評価します。 フラップを1.5cm x 6cmの2つの部分に縦方向に分割して組織サンプリングを行います。 室温で4%パラホルムアルデヒドを有する生検容器に一部を浸漬し、さらなる組織学的分析を行います。 凍結保存チューブに組織の他の部分を導入し、液体窒素に浸し、その後、将来の分子分析のために-80°Cで保存することにより、チューブを凍結保存します。 倫理委員会の勧告に従って2 M KCl/kgの急速な心内注射を使用して、一般的な吸入麻酔下でラットを安楽死させる。