Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o comitê de ética do Centro de Cirurgia Minimamente Invasiva Jesús Usón e as diretrizes de bem-estar do governo regional que se baseiam na legislação europeia. 1. Preparação pré-cirúrgica e cirúrgica Ratos Wistar da casa que pesam 290-350 g nas gaiolas em 22-25 °C com acesso livre ao alimento e à água. Aclimatar-se por 1 semana antes da cirurgia para evitar problemas induzidos pelo estresse. Coloque um rato em uma câmara de indução anestésica, entregue 5 min de oxigênio (0,5-1 L/min) e use um vaporizador para entregar 5% de sevoflurane para induzir anestesia. Leve o rato para fora da câmara uma vez que a anestesia é induzida. Coloque a máscara facial inalação sobre o rato e fornecer uma taxa de fluxo de 2% sevoflurane para manter anestesia. Check for the lack of response to a toe pinch. Use uma pomada de proteção ocular para evitar a secagem e danos na córnea. Monitore o animal anestesia geral da seguinte forma: Coloque um termômetro retal (35,9-37,5 °C), verifique a cor da membrana mucosa e posicione um oxímetro de pulso de roedor para verificar a saturação O2 (>95%) e frequência cardíaca (250-450 bpm). Use um suporte térmico (almofadas de aquecimento elétrica ou cobertores de água circulantes) para evitar hipotermia e melhorar a recuperação pós-anestesia pós-processual. Injete 5 mL de solução fisiológica fisiológica fisiológica quente para manter a hidratação adequada. Fornecer analgesic e anti-inflamatórios (meloxicam 1 mg/kg/dia) e antibióticos profiláticos (enrofloxacin 7.5 mg/kg/dia) subcutâneosly antes do procedimento e por 5 dias pós-operatório. Raspe as áreas abdominais e inguinais do animal. Aplique povido-iodo tópico, seguido por 70% de etanol. Cubra o animal com uma cortina estéril. 2. Cirurgia gratuita do modelo da aleta da pele Usando um marcador cirúrgico, desenhe uma aba de 3 cm x 6 cm que combina um dos lados de 6 cm com a linha média do abdômen. Em seguida, faça uma incisão da pele de 6 cm na linha média do abdômen e duas incisões perpendiculares de 3 cm na parte superior e inferior da incisão de linha média de 6 cm. Para começar a dissecar o retalho de pele projetado de 3 cm x 6 cm, use tesouras e fórceps Adson para levantar a aba (em vez de um bisturi) devido à mobilidade da pele. Puxe delicadamente a aleta da área craniana para a área caudal para ajudar com a dissecação e para identificar o pedicle epigastric cercado pelo tecido conjuntivo frouxo abundante. Dissecar o pedicle da aleta sem tocá-lo ou agarrando o adventitia tão pouco como possível para evitar danificar a parede da embarcação. Use 8/0 suturas de nylon para oclude por ligaduras os vasos proximal caudal femoral, vasos femorais circumflexlatera laterais e vasos safenosos. Assim, a perfusão da aba é fornecida pela artéria femoral e continua diretamente através da artéria episórica caudal superficial, enquanto a drenagem venosa é realizada pela veia episórica caudal superficial em direção à veia femoral. Aperte o pépé vascular e corte-o para iniciar o período de isquemia de 8 h. Durante o procedimento, use cobertores elétricos para manter a temperatura. Duas injeções de 5 ml de solução salina quente (25°C) de 0,9% são administradas de forma subcutânea. A primeira administração é realizada 2 h após o início do procedimento; e o segundo no final do procedimento para obter uma recuperação adequada do animal. Use solução salina heparinizada (100 U/mL) para perfundir a aba e remover o sangue estagnado da microcirculação. Use 10/0 suturas de nylon para realizar o anastomoses microcirúrgico. Após 8 h de isquemia, reperfuse a aleta removendo as braçadeiras microvasculares e verific o patency vascular como descrito abaixo. 3. Avaliação Intraoperatória Realize um teste manual de patência (teste vazio e recarreguo) para a veia e a artéria. Para fazer isso, use duas fórceps microcirúrgicos, posicione-os distal à anastomose e realize a ordenha. Libere os fórceps mais próximos do local da anastomose primeiro. Se o fluxo sanguíneo continuar depois que uma seção vascular for esvaziada, então a anastomose é patente. Avalie o fluxo sanguíneo usando um flowmeter de ultra-som em tempo de trânsito e sondas microcirúrgicas. Medir o diâmetro das embarcações do pedicle a fim escolher o tamanho apropriado para as pontas de prova do fluxo.Nota: Uma sonda de fluxo de 0,7 mm pode medir embarcações que variam de 0,4 mm a 0,7 mm; uma sonda de fluxo de 1,0 mm pode medir embarcações que variam de 0,7 mm a 1,0 mm; uma sonda de fluxo de 1,5 mm pode medir vasos que variam de 1,0 mm a 1,5 mm. Coloque a embarcação alvo na janela de detecção ultrassônica (entre o refletor e os transdutores) da sonda de fluxo para quantificar o volume de fluxo.Nota: Segure a sonda neutra no plano da embarcação, para evitar qualquer tensão ou puxar. Verifique a qualidade do acoplamento acústico, observando que todas as barras são verdes na tela.Nota: Se difícil obter um bom acoplamento acústico, use gel ultra-sônico ou solução fisiológica salina topicamente. Quando um bom acoplamento é alcançado e o navio é colocado na janela acústica sem qualquer tensão, clique no botão Record no visor para armazenar os dados.Nota: Para obter uma medida confiável e correta, certifique-se de que o padrão de forma de onda é constantemente repetível. Uma vez feito, use ácido poliglicólico (PGA) 4-0 suturas trançadas absorvíveis (16mm 3/8 agulha triangular) para fechar a pele. Use um padrão simples interrompido para manter a força e a posição do tecido se parte da sutura for mordida pelo rato no pós-operatório. Avalie a microcirculação da aba usando análise de contraste de speckle a laser (LASCA). Faça uma nova gravação para cada animal e para cada acompanhamento do estudo. Para isso, clique em Arquivo/Nova Gravação. Uma nova janela se abre e o Painel de Configuração é exibido. Em seguida, eitifique as informações do nome do projeto, assunto, operador e nome de gravação. Para a reprodutibilidade máxima, padronizar os seguintes parâmetros: distância de trabalho, área de medição, densidade de pontos, taxa de quadros e condições de luz ambiente. Ajuste a distância de trabalho movendo o laser em relação ao tecido. Zoom dentro ou para fora da cabeça laser para o tecido de interesse. Para verificar se há o valor medido, clique na configuração de imagem. Aqui, fixado em 12,0 cm. Padronizar a área de medição, inserindo a largura desejada e altura na configuraçãode imagem . A aba projetada mede 3 cm x 6 cm. Para esta medida, selecione uma largura de 4,0 cm e uma altura de 7,0 cm para ter algum espaço extra. Defina a densidade de pontos tão alta na configuração de imagem. Alta, média e baixa são as três opções. Na configuração de captura de imagem, selecione a Taxa de Quadro (10 imagens/s) para a gravação e a Duração (1 min) da gravação.Nota: Tenha a mesma condição de luz ambiente na sala de cirurgia durante a operação ou realização das avaliações. Clique no botão Gravar para começar a gravar. O Painel de Configuração é substituído pelo Painel de Gravação. Os dados são salvos automaticamente. Tire instantâneos durante o procedimento para permitir uma comparação mais aprofundada.Nota: A escala de perfusão pode ser alterada para melhorar a visualização (Ferramentas de clique | Filtros e escalas de cores | Escala de perfusão | Manual 0 – 150),mas os valores medidos de perfusão não serão afetados. Antes e depois da gravação, diferentes regiões de interesse (ROIs) podem ser criadas para medir a perfusão dentro deles. Aqui, avaliamos apenas a área do retalho praticado (3 cm x 6 cm). Use o software ImageJ para medir as áreas de sobrevivência e necrose. Localizar uma régua ao lado da aba e, em seguida, tirar fotos de controle para medições macroscópicas da área de sobrevivência flap. Para avaliar as imagens, abra a interface do usuário ImageJ. Clique no Arquivo e abra a imagem a ser medida. Selecione linha reta na caixa de ferramentas e desenhe uma linha reta sobre 1 cm da régua. Clique na Análise | Definir escala e introduzir na caixa de texto para a distância conhecida o valor de 1 cm. Clique na Ferramenta de Seleção de Polígono e desenhe as linhas de polígono sobre a aba para calcular a área viável. Em última análise, clique em Analisar | Medida para obter o valor da área. Coloque um curativo pós-operatório sobre o animal antes da habitação para evitar a automutilação da área cirúrgica. Após os procedimentos, os animais estão alojados em gaiolas individualmente, em uma sala com controle de temperatura (22°C a 25°C). 4. Avaliação pós-operatória e amostragem de tecidos Anestesie o rato em 7 dias pós-operatórios para a avaliação da aba e amostragem de tecidos, seguindo os mesmos passos previamente descritos neste protocolo (passos 1.2 e 1.3). Verifique se há profundidade de anestesia pela falta de resposta à pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do lado. Fotografe a área cirúrgica para permitir medições macroscópicas das áreas de sobrevivência e necrose da aleta. Faça as medições macroscópicas pós-operatórias seguindo as mesmas etapas da avaliação intraoperatória que foram explicadas anteriormente no protocolo (passo 3.5).Nota: Preste atenção ao usar a Ferramenta de Seleção de Poligão, desenhando as linhas na aba delimitando a área viável (medida em cm2). O percentual da área viável pode ser calculado como (cm2 de área viável/cm2 da área total da aba) × 100. Avalie a microcirculação do retalho utilizando a técnica LASCA (passo 3.4) para visualizar e quantificar as diferenças de perfusão Após a análise macroscópica, retire as suturas 4/0 e levante a aba para reavaliar o fluxo sanguíneo do pedicle vascular usando o ultra-som do trânsito-tempo. Realize a amostragem de tecidos dividindo longitudinalmente a aba em duas partes de 1,5 cm x 6 cm. Mergulhe uma parte em um recipiente de biópsia com paraformaldeído de 4% à temperatura ambiente para novas análises histológicas. Introduza a outra parte do tecido em um tubo de criopreservação, mergulhe-o em nitrogênio líquido e, em seguida, criopreserve o tubo armazenando-o a -80 °C para futuras análises moleculares. Eutanásia do rato anestesia de inalação geral usando uma injeção intracardíaca rápida de 2 M KCl/kg de acordo com as recomendações do comitê ético.