Targeting Drugs aan Larvale Zebrafish Macrofagen door injecterendrug-loaded Liposomen

Het mononucleaire fagocytesysteem biedt een eerste verdedigingslinie tegen binnendringende ziekteverwekkers. Dit systeem bestaat uit monocyten, monocyten-afgeleide dendritische cellen en macrofagen, die actief fagocytoze vreemde ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van ziekteverwekkers wordt beperkt. Naast deze fagocytische en microbicidale effectorfuncties zijn dendritische cellen en macrofagen ook in staat cytokineproductie en antigeenpresentatie om het adaptieve immuunsysteem te activeren¹. Van deze cellen hebben macrofagen bijzondere aandacht gekregen vanwege hun diverse functionele heterogeniteit en betrokkenheid bij meervoudige ontstekingsziekten, van auto-immuniteit en infectieziekten tot kanker^2,3,4,5,6,7. De plasticiteit van macrofagen en hun vermogen om zich functioneel aan te passen aan de behoeften aan hun weefselomgeving vereisen experimentele benaderingen om deze cellen in vivo rechtstreeks te observeren en te ondervragen.

Larve zebravissen zijn een ideaal model organisme waarmee de functie en plasticiteit van macrofagen in vivo⁸te bestuderen. De optische transparantie van larve zebravissen biedt een venster om het gedrag van macrofagen direct te observeren, vooral in combinatie met macrofaagmarkeringtransgene reporterlijnen. Het benutten van het levende beeldvormingspotentieel en de experimentele traktaat van larvezebravissen heeft geleid tot veel significante inzichten in de macrofaagfunctie die direct relevant zijn voor de menselijke ziekte^{9,10,11,12,13,14,15}. Veel van deze studies hebben ook gebruik gemaakt van de hoge instandhouding van de activiteit van drugs bij zebravissen (een attribuut dat hun gebruik als een hele dierlijke drug discovery platform^16,17,18), door gebruik te maken van chemische interventies om farmacologisch te manipuleren macrofaag functie. Tot op heden zijn deze farmacologische behandelingen meestal geleverd door onderdompeling, waardoor het medicijn in water oplosbaar moet zijn, of door directe micro-injectie van vrij geneesmiddel(figuur 1A). Beperkingen van deze passieve leveringsstrategieën omvatten off-target effecten en algemene toxiciteit die de beoordeling van eventuele gevolgen voor de macrofaagfunctie kunnen uitsluiten. Bovendien, bij het onderzoeken van drugseffecten op macrofagen is het onbekend of de geneesmiddelen handelen op de macrofagen zelf of door meer indirecte mechanismen. Bij het uitvoeren van soortgelijke chemische interventie studies om macrofaag functie te onderzoeken, erkenden we dat er een onvervulde noodzaak om een goedkope en eenvoudige leveringsmethode te ontwikkelen om drugs specifiek richten op macrofagen.

Liposomen zijn microscopisch, biocompatibel, lipide tweelaagse blaasjes die eiwitten, nucleotiden en drugslading kunnen inkapselen¹⁹. De unilamellar of multilamellar lipide bilayer structuur van liposomen vormt een waterig binnenlumen waar in water oplosbare geneesmiddelen kunnen worden opgenomen, terwijl hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden geïntegreerd in de lipide membranen. Bovendien kunnen de fysischchemische eigenschappen van liposomen, waaronder grootte, lading en oppervlaktemodificaties, worden gemanipuleerd om hun targeting af te stemmen op specifieke cellen^20,21. Deze kenmerken van liposomen hebben ze een aantrekkelijk voertuig om drugs te leveren en de precisie van de huidige behandeling regimes²⁰te verbeteren. Aangezien liposomen van nature worden gefagocytozed door macrofagen (een functie die wordt uitgebuit door hun routinematiggebruik bij het specifiek leveren van clodronaat aan macrofagen voor ablatieexperimenten^22),presenteren zij zich als een aantrekkelijke optie voor macrofaagspecifieke geneesmiddelenlevering(figuur 1B).

Dit protocol beschrijft de formulering van geneesmiddelen in blauwe fluorescerende liposomen bekleed met de hydrofiele polymeer poloxamer 188, dat vormt een beschermende laag op het liposoom oppervlak en is aangetoond dat het behoud van geneesmiddelen te verbeteren en hebben superieure biocompatibiliteit²³. Poloxamer werd gekozen voor oppervlaktecoating van liposomen, omdat ons vorige onderzoek had aangetoond dat, in vergelijking met polyethyleenglycol gemodificeerde liposomen, poloxamer gemodificeerde liposomen betere biocompatibiliteit vertoonden na onderhuidse injectie van rattenpoten en soortgelijke farmacokinetiek bij konijnen na intraveneuze infusie²³. Protocollen worden ook beschreven voor hun micro-injectie in larve zebravissen en live beeldvorming om hun macrofaag-targeting vermogen en lokalisatie te beoordelen naar intracellulaire compartimenten die nodig zijn voor liposoomafbraak en cytoplasmatische drug levering. Als proof-of-concept hebben we deze techniek eerder gebruikt om twee geneesmiddelen op macrofagen te richten om hun activering te onderdrukken in een larve zebravismodel van acute jichtontsteking²⁴. Deze drug levering techniek breidt de chemische “toolkit” beschikbaar voor zebravis onderzoekers willen macrofaag-targeting van hun drugs van belang te waarborgen.