概要

Targeting Drogen zu Larval Zebrafish Makrophagen durch Injektion von Drogen-geladenen Liposomen

Published: February 18, 2020
doi:

概要

Hier beschreiben wir die Synthese von medikamentenbelasteten Liposomen und deren Mikroinjektion in Larvenzebrafische zum Zweck der gezielten Medikamentenabgabe an Makrophagen-Linienzellen.

Abstract

Zebrafische (Danio rerio) Larven haben sich zu einem beliebten Modell entwickelt, um Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen und den Beitrag angeborener Immunzellen zu entzündlichen Erkrankungen aufgrund ihres funktionell konservierten angeborenen Immunsystems zu untersuchen. Sie sind auch weit verbreitet, um zu untersuchen, wie angeborene Immunzellen helfen, Entwicklungsprozesse zu leiten. Durch die Nutzung der optischen Transparenz und genetischen Traktionsfähigkeit von Larvenzebrafischen konzentrieren sich diese Studien häufig auf live-bildgebende Ansätze zur funktionellen Charakterisierung fluoreszierend markierter Makrophagen und Neutrophilen innerhalb intakter Tiere. Aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Heterogenität und der ständig wachsenden Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten haben Makrophagen erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Neben genetischen Manipulationen werden chemische Eingriffe nun routinemäßig eingesetzt, um das Makrophagenverhalten bei Larvenzebrafischen zu manipulieren und zu untersuchen. Die Lieferung dieser Medikamente ist in der Regel auf passive Simtung von kostenlosen Medikamenten durch direktes Eintauchen oder Mikroinjektion beschränkt. Diese Ansätze beruhen auf der Annahme, dass jede Änderung des Makrophagenverhaltens das Ergebnis einer direkten Wirkung des Arzneimittels auf die Makrophagen selbst ist und keine nachgelagerte Folge einer direkten Auswirkung auf einen anderen Zelltyp. Hier stellen wir unsere Protokolle zur Gezielten Ausrichtung auf Larvenzebrafische Makrophagen durch Mikroinjizieren von medikamentösen fluoreszierenden Liposomen vor. Wir zeigen, dass Poloxamer 188-modifizierte medikamentöse blaue fluoreszierende Liposomen leicht von Makrophagen und nicht von Neutrophilen aufgenommen werden. Wir liefern auch Beweise dafür, dass Auf diese Weise gelieferte Medikamente die Makrophagenaktivität in einer Weise beeinflussen können, die mit dem Wirkmechanismus des Medikaments im Einklang steht. Diese Technik wird für Forscher von Nutzen sein, die sicherstellen wollen, dass Medikamente auf Makrophagen ausgerichtet werden und wenn Medikamente zu toxisch sind, um mit traditionellen Methoden wie Demonsion geliefert zu werden.

Introduction

Das mononukleare Phagozytensystem bietet eine erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger. Dieses System besteht aus Monozyten, monozytenabgeleiteten dendritischen Zellen und Makrophagen, die aktiv fremde Krankheitserreger phagozytieren und so die Ausbreitung von Krankheitserregern begrenzen. Zusätzlich zu diesen phagozytischen und mikrobiziden Effektorfunktionen sind dendritische Zellen und Makrophagen auch in der Lage, Zytokin zu production und Antigen-Präsentation, um das adaptive Immunsystem zu aktivieren1. Von diesen Zellen haben Makrophagen aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Heterogenität und Beteiligung an multiplen entzündlichen Erkrankungen, von Autoimmunität und Infektionskrankheiten bis hin zu Krebs2,3,4,5,6,7,besondere Aufmerksamkeit erhalten. Die Plastizität von Makrophagen und ihre Fähigkeit, sich funktionell an die Bedürfnisse ihrer Gewebeumgebung anzupassen, erfordern experimentelle Ansätze, um diese Zellen in vivo direkt zu beobachten und zu befragen.

Larval Zebrafische sind ein idealer Modellorganismus, um die Funktion und Plastizität von Makrophagen in vivo8zu untersuchen. Die optische Transparenz von Larvenzebrafischen bietet ein Fenster, um das Verhalten von Makrophagen direkt zu beobachten, insbesondere in Verbindung mit transgenen Reporterlinien, die makrophagen markieren. Die Nutzung des Live-Bildgebungspotenzials und der experimentellen Traktionsfähigkeit von Larvenzebrafischen hat zu vielen bedeutenden Erkenntnissen über die Makrophagenfunktion geführt, die direkte Relevanz für die menschliche Krankheit haben9,10,11,12,13,14,15. Viele dieser Studien haben auch die hohe Erhaltung der Drogenaktivität bei Zebrafischen genutzt (ein Attribut, das ihre Verwendung als ganzes Tier Arzneimittel Entdeckungplattform16,17,18) durch die Verwendung chemischer Interventionen, um pharmakologisch zu manipulieren Makrophagen Funktion. Bis heute wurden diese pharmakologischen Behandlungen meist entweder durch Eintauchen, das wasserlöslich es erfordert, oder durch direkte Mikroinjektion von freiem Medikament geliefert (Abbildung 1A). Zu den Einschränkungen dieser passiven Lieferstrategien gehören Off-Target-Effekte und allgemeine Toxizität, die eine Bewertung der Auswirkungen auf die Makrophagenfunktion ausschließen können. Darüber hinaus ist bei der Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf Makrophagen nicht bekannt, ob die Medikamente auf die Makrophagen selbst oder durch indirekteMechanismen wirken. Bei der Durchführung ähnlicher chemischer Interventionsstudien zur Untersuchung der Makrophagenfunktion erkannten wir, dass es eine unerfüllte Notwendigkeit gab, eine kostengünstige und unkomplizierte Verabreichungsmethode zu entwickeln, um Medikamente speziell auf Makrophagen auszurichten.

Liposomen sind mikroskopische, biokompatible, lipidbilayerierte Vesikel, die Proteine, Nukleotide und Drogenfracht verkapseln können19. Die unilamellare oder multilamellare Lipid-Doppelschichtstruktur von Liposomen bildet ein wässriges inneres Lumen, in dem wasserlösliche Medikamente eingearbeitet werden können, während hydrophobe Medikamente in die Lipidmembranen integriert werden können. Darüber hinaus können die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Liposomen, einschließlich Größe, Ladung und Oberflächenmodifikationen, manipuliert werden, um ihre Ausrichtung auf bestimmte Zellen20,21zuzuschneiden. Diese Eigenschaften von Liposomen haben sie zu einem attraktiven Vehikel gemacht, um Medikamente zu liefern und die Präzision der aktuellen Behandlungsschemata zu verbessern20. Da Liposomen natürlich durch Makrophagen phagozytoisiert werden (ein Merkmal, das durch ihre routinemäßige Verwendung bei der Bereitstellung von Clodronat speziell für Makrophagen für Ablationsexperimente genutzt wird22), stellen sie als attraktive Option für die makrophagenspezifische Arzneimittelabgabe dar (Abbildung 1B).

Dieses Protokoll beschreibt die Formulierung von Medikamenten in blaue fluoreszierende Liposomen, die mit dem hydrophilen Polymer Poloxamer 188 beschichtet sind, das eine Schutzschicht auf der Liposomenoberfläche bildet und nachweislich die Arzneimittelretention verbessert und eine überlegene Biokompatibilitäthat 23. Poloxamer wurde für die Oberflächenbeschichtung von Liposomen ausgewählt, da unsere bisherigen Forschungen gezeigt hatten, dass Poloxamer modifizierte Liposomen im Vergleich zu Polyethylenglykolmodifizierten Liposomen eine bessere Biokompatibilität nach subkutaner Injektion von Rattenpfoten und ähnlicher Pharmakokinetik bei Kaninchen nach intravenöser Infusionzeigten 23. Protokolle werden auch für ihre Mikroinjektion in Larvenzebrafische und Live-Bildgebung beschrieben, um ihre Makrophagen-Targeting-Fähigkeit und Lokalisierung in intrazelluläre Kompartimente zu bewerten, die für den Liposomenabbau und die zytoplasmatische Arzneimittelabgabe notwendig sind. Als Proof-of-Concept haben wir diese Technik bereits verwendet, um zwei Medikamente auf Makrophagen zu zielen, um ihre Aktivierung in einem Larven-Zebrafischmodell der akuten Gichtentzündung zu unterdrücken24. Diese Medikamentenabgabetechnik erweitert das chemische “Toolkit”, das Zebrafischforschern zur Verfügung steht, die eine Makrophagen-Targeting ihrer Medikamente von Interesse sicherstellen wollen.

Protocol

1. Zubereitung von drogenbeladenen Marina Blue-labeled Liposomen HINWEIS: Liposomen, die den blauen Fluoreszenzfarbstoff, Marina Blue und das Medikament tragen, werden mit einer Dünnschichthydratationsmethode mit Post-Insertion von Poloxamer 188 hergestellt. Alle Eingriffe werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Kontrollliposomen tragen nur Marina blue und PBS. Das Beispiel hier beschreibt das Laden von Liposomen mit einem Mitochondrien-targeting-Antioxidans-Medi…

Representative Results

Der hier beschriebene Ansatz zur Dünnschichthydratation zur Herstellung fluoreszierender Liposomen, die Arzneimittel einschließen, ist eine einfache und kostengünstige Methode. Mit dem in dieser Studie verwendeten Protokoll werden die Liposomen voraussichtlich unilamellar23,24sein. Die Größe, das Zeta-Potenzial, die Lade- und Einschließungseffizienz der hergestellten Liposomen sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die Partikelgröße der Liposo…

Discussion

Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur Formulierung von medikamentenbelasteten Liposomen zur Verfügung gestellt, um gezielt Makrophagen in Larvenzebrafischen zu zielen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Makrophagen in bestimmten Krankheitsmodellen zu sezieren, indem eine direkte gezielte Abgabe von Medikamenten speziell auf Makrophagen sichergestellt wird. Darüber hinaus kann es verwendet werden, wenn die allgemeine Toxizität von Medikamenten ihre Verwendung begrenzt, wenn sie auf konventio…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Stipendien unterstützt, die c.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) und Z.W. (Faculty Research Development Fund von der University of Auckland) verliehen wurden. Die Autoren danken Alhad Mahagaonkar für das fachkundige Management der Zebrafischanlage, der Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Graham Lieschke für die Begabung der Tg(mpeg1:EGFP) Reporterlinie.

Materials

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600

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記事を引用
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