概要

Targeting Drugs aan Larvale Zebrafish Macrofagen door injecterendrug-loaded Liposomen

Published: February 18, 2020
doi:

概要

Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.

Abstract

Zebravissen (Danio rerio) larven hebben zich ontwikkeld tot een populair model om gastheer-pathogene interacties en de bijdrage van aangeboren immuuncellen aan ontstekingsziekten te wijten aan hun functioneel bewaard gebleven immuunsysteem te onderzoeken. Ze worden ook veel gebruikt om te onderzoeken hoe aangeboren immuuncellen helpen bij het begeleiden van ontwikkelingsprocessen. Door gebruik te maken van de optische transparantie en genetische aallaatbaarheid van larve zebravissen, richten deze studies zich vaak op live beeldvormingsbenaderingen om fluorescerend gemarkeerde macrofagen en neutrofielen binnen intacte dieren functioneel te karakteriseren. Door hun diverse functionele heterogeniteit en steeds groeiende rollen bij pathogenese van ziekten, hebben macrofagen veel aandacht gekregen. Naast genetische manipulaties worden chemische interventies nu routinematig gebruikt om macrofaaggedrag bij larve zebravissen te manipuleren en te onderzoeken. Levering van deze geneesmiddelen is meestal beperkt tot passieve targeting van gratis drug door middel van directe onderdompeling of micro-injectie. Deze benaderingen vertrouwen op de veronderstelling dat eventuele veranderingen in macrofaaggedrag het resultaat zijn van een direct effect van het medicijn op de macrofagen zelf, en niet een stroomafwaarts gevolg van een direct effect op een ander celtype. Hier presenteren we onze protocollen voor het specifiek richten van drugs op larve zebravissen macrofagen door microinjecterende door drugs geladen fluorescerende liposomen. We onthullen dat poloxamer 188-gemodificeerde drug-loaded blauwe fluorescerende liposomen gemakkelijk worden opgenomen door macrofagen, en niet door neutrofielen. We leveren ook bewijs dat drugs die op deze manier worden geleverd, macrofaagactiviteit kunnen beïnvloeden op een manier die in overeenstemming is met het werkingsmechanisme van het medicijn. Deze techniek zal van waarde zijn voor onderzoekers die ervoor willen zorgen dat geneesmiddelen worden gericht op macrofagen en wanneer geneesmiddelen te giftig zijn om te worden geleverd met traditionele methoden zoals onderdompeling.

Introduction

Het mononucleaire fagocytesysteem biedt een eerste verdedigingslinie tegen binnendringende ziekteverwekkers. Dit systeem bestaat uit monocyten, monocyten-afgeleide dendritische cellen en macrofagen, die actief fagocytoze vreemde ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van ziekteverwekkers wordt beperkt. Naast deze fagocytische en microbicidale effectorfuncties zijn dendritische cellen en macrofagen ook in staat cytokineproductie en antigeenpresentatie om het adaptieve immuunsysteem te activeren1. Van deze cellen hebben macrofagen bijzondere aandacht gekregen vanwege hun diverse functionele heterogeniteit en betrokkenheid bij meervoudige ontstekingsziekten, van auto-immuniteit en infectieziekten tot kanker2,3,4,5,6,7. De plasticiteit van macrofagen en hun vermogen om zich functioneel aan te passen aan de behoeften aan hun weefselomgeving vereisen experimentele benaderingen om deze cellen in vivo rechtstreeks te observeren en te ondervragen.

Larve zebravissen zijn een ideaal model organisme waarmee de functie en plasticiteit van macrofagen in vivo8te bestuderen. De optische transparantie van larve zebravissen biedt een venster om het gedrag van macrofagen direct te observeren, vooral in combinatie met macrofaagmarkeringtransgene reporterlijnen. Het benutten van het levende beeldvormingspotentieel en de experimentele traktaat van larvezebravissen heeft geleid tot veel significante inzichten in de macrofaagfunctie die direct relevant zijn voor de menselijke ziekte9,10,11,12,13,14,15. Veel van deze studies hebben ook gebruik gemaakt van de hoge instandhouding van de activiteit van drugs bij zebravissen (een attribuut dat hun gebruik als een hele dierlijke drug discovery platform16,17,18), door gebruik te maken van chemische interventies om farmacologisch te manipuleren macrofaag functie. Tot op heden zijn deze farmacologische behandelingen meestal geleverd door onderdompeling, waardoor het medicijn in water oplosbaar moet zijn, of door directe micro-injectie van vrij geneesmiddel(figuur 1A). Beperkingen van deze passieve leveringsstrategieën omvatten off-target effecten en algemene toxiciteit die de beoordeling van eventuele gevolgen voor de macrofaagfunctie kunnen uitsluiten. Bovendien, bij het onderzoeken van drugseffecten op macrofagen is het onbekend of de geneesmiddelen handelen op de macrofagen zelf of door meer indirecte mechanismen. Bij het uitvoeren van soortgelijke chemische interventie studies om macrofaag functie te onderzoeken, erkenden we dat er een onvervulde noodzaak om een goedkope en eenvoudige leveringsmethode te ontwikkelen om drugs specifiek richten op macrofagen.

Liposomen zijn microscopisch, biocompatibel, lipide tweelaagse blaasjes die eiwitten, nucleotiden en drugslading kunnen inkapselen19. De unilamellar of multilamellar lipide bilayer structuur van liposomen vormt een waterig binnenlumen waar in water oplosbare geneesmiddelen kunnen worden opgenomen, terwijl hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden geïntegreerd in de lipide membranen. Bovendien kunnen de fysischchemische eigenschappen van liposomen, waaronder grootte, lading en oppervlaktemodificaties, worden gemanipuleerd om hun targeting af te stemmen op specifieke cellen20,21. Deze kenmerken van liposomen hebben ze een aantrekkelijk voertuig om drugs te leveren en de precisie van de huidige behandeling regimes20te verbeteren. Aangezien liposomen van nature worden gefagocytozed door macrofagen (een functie die wordt uitgebuit door hun routinematiggebruik bij het specifiek leveren van clodronaat aan macrofagen voor ablatieexperimenten22),presenteren zij zich als een aantrekkelijke optie voor macrofaagspecifieke geneesmiddelenlevering(figuur 1B).

Dit protocol beschrijft de formulering van geneesmiddelen in blauwe fluorescerende liposomen bekleed met de hydrofiele polymeer poloxamer 188, dat vormt een beschermende laag op het liposoom oppervlak en is aangetoond dat het behoud van geneesmiddelen te verbeteren en hebben superieure biocompatibiliteit23. Poloxamer werd gekozen voor oppervlaktecoating van liposomen, omdat ons vorige onderzoek had aangetoond dat, in vergelijking met polyethyleenglycol gemodificeerde liposomen, poloxamer gemodificeerde liposomen betere biocompatibiliteit vertoonden na onderhuidse injectie van rattenpoten en soortgelijke farmacokinetiek bij konijnen na intraveneuze infusie23. Protocollen worden ook beschreven voor hun micro-injectie in larve zebravissen en live beeldvorming om hun macrofaag-targeting vermogen en lokalisatie te beoordelen naar intracellulaire compartimenten die nodig zijn voor liposoomafbraak en cytoplasmatische drug levering. Als proof-of-concept hebben we deze techniek eerder gebruikt om twee geneesmiddelen op macrofagen te richten om hun activering te onderdrukken in een larve zebravismodel van acute jichtontsteking24. Deze drug levering techniek breidt de chemische “toolkit” beschikbaar voor zebravis onderzoekers willen macrofaag-targeting van hun drugs van belang te waarborgen.

Protocol

1. Voorbereiding van drug-geladen Marina Blue-gelabeld Liposomen OPMERKING: Liposomen die de blauwe fluorescerende kleurstof, Marina Blue en drug worden bereid met behulp van een dunne film hydratatie methode met post inbrengen van poloxamer 188. Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Controle liposomen dragen alleen Marina blauw en PBS. Het voorbeeld hier beschrijft het laden van liposomen met een mitochondria-targeting antioxidant drug<sup class="xref…

Representative Results

De dunne film hydratatie aanpak hier beschreven voor de voorbereiding van fluorescerende liposomen omsluiten van drugs is een eenvoudige en kosteneffectieve methode. Met het protocol dat in deze studie wordt gebruikt, zullen de liposomen naar verwachting unilamellar23,24zijn. De grootte, zeta potentieel, drug laden en beknelling efficiëntie van de geproduceerde liposomen zijn samengevat in tabel 1. De deeltjesgrootte van de liposomen (voor en na…

Discussion

Hier hebben we een gedetailleerd protocol om met drugs geladen liposomen te formuleren om specifiek macrofagen bij larve zebravissen aan te pakken. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van macrofagen in bepaalde ziektemodellen te ontleden door te zorgen voor directe gerichte levering van geneesmiddelen specifiek aan macrofagen. Bovendien kan het worden gebruikt wanneer de algemene toxiciteit van geneesmiddelen het gebruik ervan beperkt wanneer ze worden geleverd door meer conventionele routes, zoals onderdompeling….

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) en Z.W. (Faculty Research Development Fund van de Universiteit van Auckland). De auteurs bedanken Alhad Mahagaonkar voor deskundig beheer van de zebravis faciliteit, de Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, Universiteit van Auckland voor hulp bij confocale beeldvorming en Graham Lieschke voor gifting de Tg (mpeg1:EGFP) reporter lijn.

Materials

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600

参考文献

  1. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  2. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  3. Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
  4. Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
  5. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
  6. Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  9. Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
  10. Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
  11. Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
  14. Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  15. Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
  16. Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
  17. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  18. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  19. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
  20. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
  21. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  22. Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
  23. Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
  24. Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
  25. Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
  26. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
  27. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
  28. Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
  29. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  30. Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
  31. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  32. Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
  33. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  34. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  35. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers–liposomes and microspheres–on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
  36. Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
  37. Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
  38. Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
  39. Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
  40. Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
  41. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
  42. Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
  43. Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. がん研究. 40 (12), 4460-4466 (1980).
  44. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).

Play Video

記事を引用
Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. W., Dalbeth, N., Wu, Z., Hall, C. J. Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes. J. Vis. Exp. (156), e60198, doi:10.3791/60198 (2020).

View Video