细胞和组织中辅酶A的定量

辅酶A（CoA）是所有生物中必不可少的合成物，由泛酸（也称为泛酸盐）或维生素B5合成。CoA是有机酸的主要细胞内载体，包括短链酸，如醋酸和琥珀酸，亚链酸，如丙酸和甲基甲酸酯，长链脂肪酸，如棕榈酸和油酸盐，超长链脂肪酸，如多不饱和脂肪酸，异种生物，如丙丙酸。有机酸与CoA酶形成硫酯联联系，使其在100多个中间^代谢1反应中用作基质。CoA 硫化物也是基洛斯特调节剂和转录活化剂。现在，人们^赞赏2，细胞总CoA供应是^调节3，4;因此，CoA的可用性可以受到限制，CoA的缺陷可能是灾难性的，例如影响CoA生物^合成5的遗传性遗传性疾病。泛酸激酶催化CoA生物合成的第一步（图1）和泛酸激酶相关神经退化，称为PKAN，是由PANK2^基因6的突变引起的。CoA合成酶，由COASYN基因编码，催化CoA生物合成的最后两个步骤（图1）和COASY蛋白相关的神经退化，称为CoPAN，是由COASYN^基因7的突变引起的。PKAN 和 CoPAN 都是遗传性神经退行性疾病，与大脑中的铁积累和 CoA 缺乏疾病病理学有关。

在组织⁸之间，总 CoA 的细胞水平各不相同，在各种生理、病理和药理状态下，总 CoA 可以增加或减少。肝CoA增加期间燃料从饲料切换到禁食^状态9，肝CoA水平异常高的瘦素缺乏肥胖^小鼠10。肝CoA减少对慢性乙醇^摄入11。Pank2敲除小鼠模型中的脑CoA水平在围产期被抑制，但后来在成人阶段大脑CoA含量相当于野生型水平，表明在发育过程中有自适应CoA^反应。通过转因或基因传递方法操作组织CoA含量会影响代谢和神经功能13、14、15。PKAN 或 CoPAN 潜在疗法的临床前开发包括细胞或组织 CoA 测量作为疗效指标 16、17、18、19、20.评估所有这些条件及其代谢或功能后果需要一种定量方法来测量总 CoA。

在许多实验室中，测量生物样品 CoA 的准确、可靠的检测是一项技术难题。不幸的是，没有探针可用于评估或量化在完整细胞中的CoA或CoA硫化物，虽然天然CoA硫化物的类比在利用^酶21的CoA酯研究中被广泛用作机械探针。CoA 与游离磺酸 （-SH） 莫伊蒂一起转换为 CoA 硫化物（反之亦然）在转移到不同环境和细胞裂解期间在细胞或动物组织中快速。细胞中的大量丙基-CoA合成酶和丙基-CoA硫酯酶在CoA池内介导转化，利用CoA硫酯作为基质的其他酶在生物样品中保持活性，直到通过化学或物理淬火意味 着。通过丙烯转移酶将丙基组从CoA卸载到肉碱，是反应网络中可能改变CoA/CoA硫酯分布的一个例子。放射性示踪剂可用于测量细胞中的CoA合成率。目前测量生物样品中的CoA和CoA衍生物的方法已经^审查了22种，包括耦合酶分光度测定测定、高压液相色谱和质谱法程序。然而，这些方法往往集中在特定的CoA分子物种上，并且对整个CoA池的变化视而不见。由于检测灵敏度低，并且线性范围有限，耦合酶测定通常需要大量输入材料。

我们的实验室已经开发出一种可靠的程序，用于定量培养细胞和动物组织中的总CoA。该战略包括所有CoA硫化物的水解，在样品制备过程中只产生免费CoA，而不是努力维持和分析CoA物种的整个谱系。该程序是单独公布的方法汇编，用于制备样品、CoA衍生、纯化和高压液相色谱 （HPLC） 后识别，以及通过吸光或荧光检测23，24，25。使用此程序获得的 CoA 测定使我们能够了解 CoA 法规，并开发治疗 CoA 缺陷的治疗方法。