Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Il coenzima A (CoA) è un cofattore essenziale in tutti gli organismi viventi ed è sintetizzato dall’acido panttheico, chiamato anche panttheanato (il sale dell’acido pantonico) o vitamina B5. Il CoA è il principale vettore intracellulare di acidi organici, compresi gli acidi a catena corta come acetato e succinato, acidi a catena di rami come propionato e metilmalo, acidi grassi a catena lunga come palmitato e oleato, acidi grassi a catena molto lunga come acidi grassi polinsaturi e xenobiotici come l’acido valproico. L’acido organico forma un collegamento tioester enzimaticamente con CoA per consentire il suo uso come substrato in oltre 100 reazioni nel metabolismo intermedio¹. I tioesteri coA sono anche regolatori allosterici e attivatori trascrizionali. Ora è apprezzato² che la fornitura totale cellulare di CoA è regolata^3,4; pertanto, la disponibilità di CoA può essere limitante e le carenze di CoA possono essere catastrofiche, come esemplificato da disturbi genetici ereditari che hanno un impatto sulla biosintesi coa⁵. Pantothenate chinaase catalizza il primo passo nella biosintesi coa (Figura 1) e Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, chiamato PKAN, è causata da mutazioni nel gene PANK2 ⁶. La sintesi della CoA, codificata dal gene COASYN, catalizza gli ultimi due passaggi nella biosintesi CoA (Figura 1) e nella Neurodegenerazione associata alle proteine COASY, chiamata CoPAN, è causata da una mutazione nel gene COASYN ⁷. Sia PKAN che CoPAN sono malattie neurodegenerative ereditarie associate all’accumulo di ferro nel cervello e alle carenze di CoA in modo inferiore alle patologie.

I livelli cellulari di CoA totale variano tra i tessuti⁸ e CoA totale può aumentare o diminuire sotto una varietà di stati fisiologici, patologici e farmacologici. Il CoA del fegato aumenta durante il passaggio del combustibile dallo stato di alimentazione allo stato digiunato⁹e i livelli di CoA epatica sono anormalmente elevati nei topi obesi carenti di leptina¹⁰. Fegato CoA diminuisce in risposta all’ingestione cronica di etanolo¹¹. I livelli di CoA cerebrale nel modello di topo knockout Pank2 sono depressi durante il periodo perinatale, ma più tardi nella fase adulta il contenuto di CoA del cervello è equivalente ai livelli di tipo selvaggio, indicando una risposta CoA adattiva durante lo sviluppo¹². Manipolazione del contenuto di CoA dei tessuti mediante transgenesi o metodi di somministrazione genica influisce sulle funzioni metaboliche e neurali^13,14,15. Lo sviluppo preclinico di potenziali terapie per PKAN o CoPAN include misurazioni CoA cellulari o tissutali come indicatori di efficacia^16,17,^18,19,20 . La valutazione di tutte queste condizioni e delle loro conseguenze metaboliche o funzionali richiede un metodo quantitativo per la misurazione del CoA totale.

Un test accurato e affidabile per misurare CoA in campioni biologici è una sfida tecnica in molti laboratori. Purtroppo, non ci sono sonde disponibili per valutare o quantificare i tioesteri CoA o CoA in cellule intatte, anche se analoghi di tioesters CoA naturali sono stati ampiamente utilizzati come sonde meccanicistiche negli studi di CoA ester utilizzando enzimi²¹. La conversione di CoA, con un solfuro libero (-SH), in un tifoso di CoA (o viceversa) è rapida nelle cellule o nei tessuti animali durante il trasferimento in un ambiente diverso e durante la lisi cellulare. Numerosi sintetasi acyl-CoA e tioesterai di CoA nelle cellule mediano le interconversioni all’interno del pool di CoA, e ulteriori enzimi che utilizzano il tioestro coa come substrati rimangono attivi in campioni biologici fino a quando non vengono spenti da prodotti chimici o fisici mezzo. L’off-loading dei gruppi acili dal CoA alla carnitina da parte dei transferasi di acyl è un esempio all’interno della rete di reazioni che possono alterare la distribuzione di coA/CoA thioester. I traccianti radioattivi possono essere utilizzati per misurare i tassi di sintesi CoA nelle cellule. Gli attuali metodi per misurare i derivati di CoA e CoA in campioni biologici sono stati esaminati²² e includono saggi spettrofotometrici enzimatici accoppiati, cromatografia liquida ad alta pressione e procedure basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, questi metodi sono spesso focalizzati su particolari specie molecolari di CoA e sono ciechi alla variazione della piscina totale di CoA. I saggi enzimatici accoppiati generalmente richiedono grandi quantità di materiale di input a causa di basse sensibilità di rilevamento e hanno una gamma limitata di linearità.

Il nostro laboratorio ha sviluppato una procedura affidabile per la quantificazione del CoA totale nelle cellule coltivate e nei tessuti animali. La strategia include l’idrolisi di tutti i tioesteri CoA per produrre solo CoA gratuito durante la preparazione del campione, piuttosto che fare sforzi per mantenere e analizzare l’intero spettro delle specie CoA. La procedura è una compilazione di singoli metodi pubblicati per la preparazione dei campioni, la derivazione del CoA, la purificazione e l’identificazione a seguito della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e la quantificazione della CoA derivata mediante assorbimento o rilevamento della fluorescenza^23,24,25. Le determinazioni CoA ottenute utilizzando questa procedura hanno permesso la nostra comprensione della regolazione CoA e lo sviluppo di un approccio terapeutico per il trattamento delle carenze di CoA.