קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Co A (CoA) הוא קופקטור חיוני בכל האורגניזמים החיים, והוא מסונתז מחומצה פנטותימית, המכונה גם פנטוידאט (מלח החומצה הפנטותית) או ויטמין B5. CoA הוא המוביל התאיים העיקרי של חומצות אורגניות, כולל חומצות שרשרת קצרות כגון אצטט ו סוזיטה, הענף חומצות שרשרת כגון propionate ו מתילמאלonate, חומצות שומן ארוכות כגון palmitate והרדוף, חומצות שומן מאוד ארוך שרשרת כגון חומצות שומן בלתי רוויות, ו xenobiotics כגון חומצה ולפרואית. החומצה האורגנית יוצרת הצמדה מבחינה דקדוקית באמצעות CoA כדי לאפשר את השימוש בה כמצע ביותר מ 100 תגובות בחילוף החומרים¹. תעודת המקוריות הן גם מחוקקים אלוסטרוקים ומפעילים מפעילי הרכב. כעת מוערך² כי הספק תעודת המקוריות של הסלולר מוסדר^3,4; לפיכך, ניתן להגביל את זמינות ה-CoA ושליקויים בתעודת המקוריות עלולים להיות קטסטרופליים, כפי שניתן למשל בהפרעות גנטיות שעברו בירושה, המשפיעים על תעודת המקוריות של CoA⁵. פנטופיפיאט קינאז מזרז את הצעד הראשון בביוסינתזה של CoA (איור 1) ופנטופיפיאט קינאז, שנקרא pkan, נגרמת על ידי מוטציות ב- PANK2 gene⁶. CoA סינתאז, מקודד על ידי הגן Coasyn , מזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה CoA (איור 1) ו Coasy חלבון הקשורים נוירוניוון, נקרא copan, נגרמת על ידי מוטציה ב- coasyn גן⁷. הן PKAN ו CoPAN עוברות בירושה מחלות ניווניות הקשורים הצטברות ברזל במוח וליקויים CoA באופן בלתי מידי הפתווגיות המחלה.

רמות הסלולר של תעודת המקוריות משתנות בין הרקמות⁸ והמקוריות הכוללות יכולות להגדיל או להצטמצם תחת מגוון של מצבים פיזיולוגיים, פתולוגיים ופרמקלוגיים. תעודת הכבד מגדילה במהלך מיתוג הדלק מתוך הפדרלי^למצבהבית, ורמות coa של הכבד גבוהות באופן חריג בעכברים שמנים לפטין לקויה¹⁰. תעודת הכבד מקטינה בתגובה בליעה אתנול כרונית¹¹. רמות CoA של המוח במודל העכבר Pank2 מדוכאים במהלך תקופת הזמן הקצוב, אך מאוחר יותר בתוכן תעודת המקוריות של המוח בשלב מבוגר מקבילה לרמות מסוג פראי, המציינות תגובת CoA מסתגלת במהלך הפיתוח¹². מניפולציה של תוכן תעודת הרקמה על ידי טרנסגנזה או שיטות משלוח גנטי משפיע על פונקציות מטבולית ועצביים^13,14,15. פיתוח טרום קליני של טיפולים פוטנציאליים pkan או copan כולל תא או מדידות תעודת הרקמה כאינדיקטורים של יעילות^{16,17,18,19,20} . הערכה של כל התנאים הללו וההשלכות המטבולית או הפונקציונליות שלהם מחייבת שיטה כמותית למדידה של תעודת המקוריות הכוללת.

שיטת מדידה מדויקת ואמינה למדידת תעודת מקוריות בדגימות ביולוגיות היא אתגר טכני במעבדות רבות. למרבה הצער, אין בדיקה זמינים כדי להעריך או לכמת CoA או CoA thioesters בתאים שלמים, למרות האנלוגיות של תעודת מקוריות הטבע השתמשו באופן נרחב כמו בבדיקות מכניסטיות במחקרים של אסתר מקוריות ניצול אנזימים²¹. ההמרה של תעודת המקוריות, עם הmoiety הסולפקסיל (-SH) ללא תשלום, לתעודת המקוריות (או להיפך) מהירה בתאים או ברקמות בעלי חיים במהלך העברה לסביבה שונה ובמהלך הפירוק התאים. מספר רב של מערכות הפעלה של acyl-CoA ו-acyl-CoA מוחק בתאים מתווך בין המרות בתוך בריכת ה-CoA, ואנזימים נוספים המשתמשים בתעודת המקוריות בחומרים מעורבבים נשארים פעילים בדגימות ביולוגיות עד לאחר התניית על ידי כימיה או פיזית אומר. מחוץ לטעינה של acyl-קבוצות מתוך CoA ל קרניטין על ידי העברת התקן הוא דוגמה אחת בתוך רשת של תגובות שיכולות לשנות את התפלגות תעודת המקוריות/coa. ניתן להשתמש במשדרים רדיואקטיביים כדי למדוד שיעורי סינתזה של CoA בתאים. שיטות נוכחיות למדידת נגזרות CoA ו-CoA בדגימות ביולוגיות נבדקו²² וכוללות מצמידים spectrophotometric מגמטיים, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה ופרוצדורות מבוססות-ספקטרומטר מסה. עם זאת, שיטות אלה מתמקדות לרוב במינים מולקולריים מסוימים של CoA ועיוורים לווריאציה של בריכת ה-CoA הכוללת. מצמידים אנזימטיים באופן כללי דורשים כמויות גדולות יותר של חומר קלט בשל רגישויות לזיהוי נמוך ויש להם מגוון מוגבל של יניאריות.

המעבדה שלנו פיתחה הליך אמין לקוונפיקציה של תעודת מקוריות בתאים מתורבתים ורקמות בעלי חיים. האסטרטגיה כוללת הידרוליזה של כל תעודת המקוריות כדי להניב רק תעודת מקוריות במהלך הכנת המדגם, במקום לבצע מאמצים לשמור ולנתח את כל הספקטרום של מינים CoA. ההליך הוא אוסף של שיטות שפורסמו בנפרד לקראת הכנה לדוגמא, תעודת זהות, טיהור וזיהוי בעקבות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות), וכימות של תעודת המקוריות על ידי ספיגת המידע או זיהוי של קרינה פלואורסצנטית^23,24,25. דטרמינציות ה-CoA המתקבלות באמצעות הליך זה אפשרו את הבנתנו את רגולציה של תעודת המקוריות ואת פיתוח הגישה הטיפולית לטיפול בליקויים בתעודת המקוריות.