用于测试 Vivo 中巨噬菌体招募的异位化学表达模型
概要
为了测试化学金对体内巨噬细胞招募的影响，使用整个原位杂交检测化学体异位表达，免疫染色用于标记巨噬细胞。实时成像用于实时观察巨噬菌体迁移。
Abstract
斑马鱼在基础和生物医学研究中被广泛使用。许多斑马鱼转基因线目前可用于标记各种类型的细胞。由于斑马鱼的胚胎体透明，研究一种化学素对体内某类细胞行为的影响是很方便的。在这里，我们提供了一个工作流程，以调查化学体内巨噬菌体迁移的功能。我们构建了一个组织特异性过度表达质粒，以过度表达IL-34，并将质粒注入单细胞级转基因鱼胚胎中，其巨噬细胞被荧光蛋白专门标记。然后，我们使用全安装荧光原位杂交和免疫染色来检测化学体表达的模式以及巨噬细胞的数量或位置。注射的WT胚胎被培养成稳定的转基因线。最后，利用共聚焦活成像直接观察稳定转基因鱼的巨噬行为，研究IL-34对体内巨噬细胞的功能。
Introduction
斑马鱼是一种原产于印度的热带硬骨淡水鱼。在基因保护方面，斑马鱼与人类1的相似度为87%。通过研究斑马鱼的基因调节、蛋白质功能和细胞行为，如迁徙、增殖et.al等，我们可以对人类的相关课题进行见解。斑马鱼胚胎可用于观察抑制色素后不同阶段早期胚胎的发育。同时，斑马鱼只需三个月就能发育成性成熟，斑马鱼每4天就能产下数百个卵。体积小，繁殖简单，繁殖能力强，这些优势使斑马鱼养殖非常节省空间，有利于大规模养殖。传统的哺乳动物模型小鼠的维护成本比斑马鱼高，因此限制了小鼠饲养的规模。在早期胚胎发育方面，由于母子宫小鼠胚胎发育的特点，小鼠胚胎在活体条件下难以观察。相反，斑马鱼胚胎在外部发育和透明，因此在显微镜下很容易观察。此外，斑马鱼很容易为相关基因功能研究构建各种转基因线。目前，各种斑马鱼转基因线可用于标记不同类型的细胞。现在，在特定位置构造转基因线来过度表达化学素，并研究化学素对斑马鱼细胞行为的作用是非常方便的。
在这里，我们提供了一个工作流程，使用斑马鱼转基因线来研究IL-34对体内巨噬细胞行为2，3，4，5，6，7的功能。首先，我们构建了基因il34的肝脏特异性过度表达质粒，并将质粒注入单细胞阶段Tg（mpeg1：GFP）鱼胚胎中，该胚胎通过荧光蛋白GFP专门标记巨噬细胞。然后，我们使用全座荧光原位杂交和免疫染色来检测il34表达的图案以及巨噬细胞的数量或位置。注射的WT胚胎被培养成稳定的转基因线。在这些步骤中，我们建立并验证了细胞因子生成线，并直观地评估了对巨噬细胞分布的影响。最后，为了研究巨噬细胞行为对细胞因子的反应，我们使用共聚焦活成像直接观察巨噬细胞迁移，以确认il34对体内巨噬细胞迁移的功能。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议允许我们研究化学对宏噬菌体体内行为的功能，并且该过程需要一些技术专长。总之，在协议中有几个关键步骤可以避免并发症：1） 选择一条合适的转基因线，显示特定且强的转基因信号，为感兴趣的细胞贴上标签;2） 选择适合成像和转基因基因过度表达的组织;3） 进行敏感和特异性的RNA探针;4） 选择适当的观察时间窗口，以准确捕获细胞行为。
在全坐式荧…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢彭景荣博士分享Tg（fabp10a：DsRed）转基因线;温子龙博士分享Tg（mpeg1：GFP）转基因线;川口孝一博士提供pTol2向量。这项工作得到了国家自然科学基金（31771594）、广东省科技计划项目（2019A030317001）和中央高校基础研究基金（D2191450）的支持。
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
参考文献
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
