Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo
概要
Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.
Abstract
Zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa básica e biomédica. Muitas linhas transgênicas de zebrafish estão atualmente disponíveis para rotular vários tipos de células. Devido ao corpo embrionário transparente de zebrafish, é conveniente para nós estudar o efeito de uma quimiocina sobre o comportamento de um determinado tipo de células in vivo. Aqui nós fornecemos um fluxo de trabalho para investigar a função de uma quimiocina na migração de macrófago in vivo. Nós construímos um plasmídeo tecido-específico do superexpressão para sobre-expressão Il-34 e injetamos o plasmídeo em embriões transgênicas da fase da um-pilha dos peixes cujos os macrófagos foram etiquetados especificamente por uma proteína fluorescente. Nós usamos então a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão do quimiocina e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Por fim, utilizou-se a imagem latente ao vivo confocal para observar diretamente o comportamento dos macrófagos no peixe transgênico estável para estudar a função da IL-34 sobre o macrófago in vivo.
Introduction
O zebrafish é um pequeno peixe tropical de água doce de ossos duros originado na Índia. A respeito da conservação genética, o zebrafish tem uma similaridade de 87% ao ser humano1. Pode fornecer-nos introspecções em assuntos relacionados do ser humano estudando o Regulamento do gene, a função da proteína e o comportamento da pilha tais como a migração, proliferação et.al no zebrafish. O embrião de zebrafish pode ser usado para observar o desenvolvimento de embriões adiantados em estágios diferentes após ter inibindo o pigmento. Enquanto isso, leva apenas três meses para que o zebrafish se desenvolva em maturidade sexual, então o zebrafish pode produzir centenas de ovos a cada 4 dias. O mini-tamanho, melhoramento simples, capacidade reprodutiva forte, estas vantagens faz a cultura do zebrafish muito espaço-economia, conducente à cultura em grande escala. O rato modelo tradicional de mamíferos tem um custo de manutenção mais elevado do que o zebrafish, limitando conseqüentemente a escala da elevação do rato. No aspecto do desenvolvimento embrionário precoce, o embrião de camundongo é difícil de observar em condições de viver devido às características do desenvolvimento embrionário do camundongo no útero materno. Pelo contrário, os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente e são transparentes, por isso são fáceis de observar um microscópio. Além disso, o zebrafish é muito fácil construir uma variedade de linhas transgênicas para a pesquisa relacionada da função do gene. Atualmente, várias linhas de zebrafish transgênicos estão disponíveis para rotular diferentes tipos de células. É muito conveniente agora para construir linhas transgênicas para sobre-expressão quimiocinas em locais específicos e estudar a função de quimiocinas no comportamento celular em zebrafish.
Aqui, fornecemos um fluxo de trabalho para a utilização da linha de zebrafish transgênica para investigar a função do Il-34 no comportamento dos macrófago in vivo2,3,4,5,6,7. Primeiramente, nós construímos um plasmídeo de superexpressão fígado-específico do gene il34 e injetamos o plasmídeo em embriões de peixes do estágio TG da um-pilha (MPEG1: GFP) que etiquetaram especificamente os macrófagos pela proteína fluorescente GFP. Então, nós usamos a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão il34 e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Nessas etapas, estabelecemos e validamos a linha produtora de citocinas e avaliamos visualmente os efeitos que podem ser observados na distribuição de macrófago. Por fim, para investigar o comportamento dos macrófago em resposta à citocina, utilizou-se a imagem viva confocal para observar diretamente a migração de macrófago para confirmar a função de il34 na migração de macrófago in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui nos permite investigar a função de uma quimiocina sobre o comportamento do macróagein vivo e o procedimento requer algum conhecimento técnico. Em síntese, existem várias etapas críticas para evitar complicações no protocolo: 1) selecionar uma linha transgênica adequada que mostre um sinal transgênico específico e forte para rotular a célula de interesse; 2) selecionar um tecido apropriado que seja acessível para a imagem latente e o overexpression do gene transgênicas; 3) faça um…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Jingrong Peng por compartilhar a linha transgênica TG (fabp10a: DsRed) ; Dr. Zilong Wen por compartilhar as linhas transgênicas TG (MPEG1: GFP) ; Dr. Koichi Kawakami para fornecer o vetor pTol2. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31771594), Guangdong ciência e tecnologia projetos plano (2019A030317001) e os fundos de investigação fundamentais para as universidades centrais (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
参考文献
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- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
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- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
