Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

Para este manuscrito, todas as amostras humanas foram adquiridas de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de revisão do Instituto (IRB) e pela Comissão de pesquisa humana na faculdade de medicina de Albany. Todas as pesquisas envolvendo animais foram rigorosamente seguidas de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Albany, bem como o guia nacional de institutos de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório . 1. coleção de espécimes intestinais humanos Colete amostras de tecido humano de acordo com os protocolos do Comitê de pesquisa da instituição. Adquira o tecido intestinal (ileocolonic) de um paciente CD diagnosticado com a fibrose e as amostras de controle dos pacientes sem a história de IBDs. Use parte do tecido intestinal para a imunohistologia, uma outra parte do tecido para analisar o mRNA, e uma parte final para a expressão da proteína de genes/marcadores fibrótica e do citocinas. Para a análise de imunohistologia, primeiro fixar a amostra de tecido humano em 4% paraformaldeído para pelo menos 48 h e, em seguida, transferi-lo para um tubo contendo 70% etanol por pelo menos 16 h. Use este tecido fixo para fazer um bloco embebido em parafina e corte 5 μm de tecido grosso secções utilizando um micrótomo tecidual. Usando uma escova, espalhe delicadamente para fora cada seção do corte em uma corrediça de vidro para manchar. Deslize a lâmina da seção do tecido com mancha do Tricrômico para detectar o depósito do colagénio, e com a mancha do αsma para detectar miofibroblastos (veja a seção 3 para a informação detalhada sobre o Tricrômico e a coloração de αsma). Examine as secções manchadas um microscópio de luz. Processe outra parte da amostra de tecido humano obtida para fazer o lisado da proteína para detectar o αsma através do borrão ocidental (veja a seção 7 para a informação detalhada sobre a análise ocidental do borrão). Obter RNA da parte final da amostra de tecido humano usando um reagente de extração (tabela de materiais) e converter mRNA em cDNA via RT-PCR. Analise genes fibróticos e citocinas por qPCR (ver seção 6 para obter informações detalhadas sobre a preparação de mRNA). 2. indução de fibrose TNBS e tratamento da rapamicina em camundongos Realizar pesquisas de animais de acordo com os protocolos de pesquisa animal aprovados pela instituição. Barbear ratos adultos ao redor da área do pescoço, a fim de pré-sensibilização para TNBS através da exposição cutânea. Mergulhe TNBS em um cotonete de algodão e, em seguida, aplique TNBS para a área raspada do pescoço do mouse.Nota: a pré-sensibilização é um passo muito importante, uma vez que melhora a resposta de hipersensibilidade tardia para iniciar a inflamação mediada por TNBS. Oito dias após a pré-sensibilização, induzem a colite por administração intra-retal uma vez por semana durante seis semanas. Aplique quatro mg de TNBS (em etanol a 25%) utilizando um enema de 100 μL através de uma seringa de 1 mL ligada a um cateter de poliuretano francês 3,5 e dê aos ratos de controlo 100 μL de etanol a 25% apenas. Anestesiam camundongos com pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) ou expõem-nos a 2,5% de isoflurano, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a administração de TNBS. Confirme a anestesia delicadamente beliscando os dedos do pé e procurando uma ausência de reflexo. Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura enquanto os ratos estão anestesia. Injetar rapamicina a 2 mg/kg/dia ou veículo (5% Tween-20 e 4% etanol) todos os dias da semana para 3-6 semanas, intraperitoneal, para ambos os controles e camundongos tratados com TNBS. Use 6 semanas TNBS pós-tratado intestino camundongos para analisar os ensaios extracelulares, incluindo histologia, citometria de fluxo, western blotting e extração de RNA. Para colher órgãos, eutanizar camundongos usando CO2 inalação e confirmar eutanásia com luxação cervical. Para colher órgãos, eutanizar camundongos usando CO2 inalação e confirmar eutanásia com luxação cervical. Após a eutanásia, abra longitudinalmente o rato em seu lado ventral usando tesouras da classe cirúrgica e fórceps. Remova o cólon inteiro do reto para a área de Ilium terminal. Transfira rapidamente os dois pontos ao gelo-frio 1x HBSS e lave os dois pontos usando o mesmo amortecedor. Meça e compare os comprimentos do cólon do controle e dos camundongos tratados com TNBS. Faça esta etapa tão rapidamente como possível para evitar secar fora dos dois pontos a fim evitar mortes da pilha. Corte os dois pontos em pedaços pequenos e mantenha a-80 ° c para o armazenamento para finalidades futuras (análise do RNA/Western blot). Use outra parte do cólon para análise FACS. Certifique-se de cortar e recolher amostras de tecido Colônico de regiões semelhantes do cólon de ambos os animais tratados com TNBS e controle.Nota: uma mortalidade de 10% a 20% é esperada com a inoculação de TNBS, embora com experiência, a taxa de mortalidade pode ser significativamente reduzida. 3. avaliação imuno-histopatológica da fibrose intestinal Corrigir tecidos humanos e/ou camundongos em 4% paraformaldeído para 48 h, e depois transferir para 70% etanol por 16 h.Nota: paraformaldeído é um produto químico neurotóxico para evitar inalar; usar uma máscara facial ao usá-lo. A parafina incorpora os tecidos fixos dos dois pontos, fatia a uma espessura de 5 μm, e põr diretamente os tecidos sobre corrediças de vidro para a histologia. Realize a coloração de H & e e trichrome Blue de acordo com as instruções do fabricante para detectar colágeno. Brevemente, primeiro desparaffinize seções submergindo o slide contendo seções em duas câmaras de xileno por 5 min em cada câmara. Enxágüe lâminas com álcool 100% por 1 min; Repita este passo três vezes. Enxague novamente com água da torneira durante 1 min. Depois disso, mergulhe as lâminas na solução de Bouin pré-aquecida a 56 ° c por 60 min. a solução de Bouin é amarela na aparência; Lave depois de tirar os slides da solução de Bouin em água da torneira por 3 min ou até que as lâminas se tornaram incolor. Mergulhe as lâminas na solução de hematoxilina de Mayer modificada por 7 min à temperatura ambiente. Lâminas de mancha por imersão em trichrome mancha por 5-8 min. imediatamente, enxaguar slides em água corrente para 5-10 s para remover o excesso de mancha de trichrome. Deshidratar slides com 100% de álcool por 1 min. Repita este procedimento três vezes. Limpar slides com xileno por 1 min e repita o passo 3x. Montagem de slides com suportes de montagem (tabela de materiais). Segure com cuidado a lamínula em uma extremidade com fórceps e deixe-a cobrir a seção inteira sem ter nenhumas bolhas. Se houver algumas bolhas, remova rapidamente as bolhas tocando na lamínula. Use imunocoloração para detectar αSMA. Bloqueie as secções do cólon no tampão de bloqueio (0,2% Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal em 1X PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Incubar com 100 μL de anticorpo primário diluído para αSMA (tabela de materiais) na solução de slides (0,2% Triton X-100 e 3% de soro de cabra normal em 1X PBS; anti-αsma 1:200) a 4 ° c durante a noite. Lave as secções três vezes com 1X PBS. Use a cabra anti-mouse IgG (H + L) conjugada com Alexa fluor 488 (tabela de materiais) como um anticorpo secundário para 2 H à temperatura ambiente. Lave as secções três vezes com 1X PBS. Use DAPI para neutralizar o núcleo por 5 min. Lave as secções três vezes com 1X PBS. Monte corrediças com suportes de montagem fluorescentes (tabela dos materiais), e selo com um lamela usando o lustrador de prego. Adquira imagens usando o microscópio confocal do LSM 880 e as imagens do processo usando o software do microscópio. Quantifique imagens tomando uma média de várias áreas selecionadas na mesma seção com o ImageJ. 4. isolação do própria intestinal do lamina e da purificação de fagócitos de Cx3Cr1+ mononucleares Abra longitudinalmente os dois pontos no gelo-frio solução de sal equilibrado de Hank (HBSS; Tabela de materiais) e lave os dois pontos com o mesmo tampão. Corte cerca de 5 cm pequenos pedaços de tecidos de cólon usando tesouras estéreis em HBSS. Transfira partes pequenas do tecido do cólon em um tubo cónico de 50 mL que contem 10 mL do amortecedor da pre-digestão (1x HBSS com 5% FBS, 5 milímetros de EDTA e de 1 milímetro DTT), e agitar por 20 minutos em 100 RPM em uma incubadora de 37 ° c11.Nota: a incubação do tecido Colônico em 37 ° c em 100 RPM que agita a condição permite a digestão eficiente do tecido do colagenase e o rendimento elevado de pilhas viáveis. Descarte o epitélio Colônico destacado passando por um filtro de células de 40 μm. Recolher o tecido remanescente do filtro e digeri-los em tampão de digestão contendo Collagenase tipo IV e DNase I (tabela de materiais) em 1x HBSS com 5% FBS por 20 min a 37 ° c a 100 RPM. Vórtice os tecidos digeridos por aproximadamente 20 s e passe através de um filtro de células de 40 μm para obter frações própria de lâmina. Centrifugue as frações da lâmina própria para a pelota para baixo as pilhas em 700 x g em 4 ° c Para excluir as células mortas da lâmina própria use um gradiente de densidade (tabela de materiais).Nota: a mídia de gradiente de densidade usada aqui (tabela de materiais) pode causar perda de células mononucleares; no entanto, ele remove muito as células mortas da preparação, que aumenta globalmente a pureza. Faça 100 mL cada uma das soluções de mídia de gradiente de densidade de 30% e 70%. Suspender as células obtidas em 10 mL da solução de 30% e sobrepor-se em cima de 5 mL da solução de 70% em um tubo de 15 mL. Centrifugue o gradiente em uma condição livre de freio em 1.000 x g e temperatura ambiente. Colete a fase do anel branco contendo linfócitos da lâmina própria, que será entre as camadas de gradiente de 30% e 70%. Lave as células obtidas por re-suspendendo no gelo-frio HBSS e centrífuga em 500 x g, 20 ° c, por 10 min. re-suspender as células em FACS (fluorescência-ativado célula de triagem) tampão (PBS, pH 7,4, com 1% BSA e 2 mm EDTA). Purify os fagócitos mononucleares da purificação das pilhas coletadas usando grânulos magnéticos e/ou classificação de FACS. Purificação magnética Antes de manchar com anticorpos, primeira superfície da pilha do bloco de pilhas do própria do lamina incubando com o bloqueador do anti-rato CD16/CD32 FC por 15 minutos no gelo. Incubar as células com anticorpos anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) juntamente com microgrânulos anti-PE (tabela de materiais) por 30 min no gelo, para capturar as células ligadas. Lave as células com o tampão FACS. Passar as células de anticorpo/talão ligado através de uma coluna de classificação de célula magnética ativada em um campo magnético para remover células não acopladas. Lave três vezes com o tampão FACS. Retire a coluna do campo magnético e empurre o êmbolo na coluna para produzir células ligadas ao cordão. Classificação FACSNota: a classificação de FACS pode ser usada no lugar da purificação magnética. Embora a purificação magnética seja um método fácil e rentável, limita-se apenas a purificar células únicas, não para subpopulações de células. Portanto, para isolar subpopulações de células, o método de classificação FACS é um método eficaz de classificação de células únicas, bem como subpopulações de células. Obstrua pilhas do própria do lamina com o bloqueador do anti-rato CD16/CD32 FC (tabela dos materiais). Células de mancha incubando com anticorpos CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, e MHCII. Classifique usando um cytometer do fluxo de FACS, gating para CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- Cells para purificar a população de Cx3Cr1 (P3 + P4). Lyse ordenou pilhas para a preparação total do RNA e detecte marcadores do citocinas e do fibrótica (veja a seção 6 para a preparação do RNA e do cDNA). Analise a expressão de mRNA dos marcadores fibrótica e da análise inflamatório do citocinas das suspensões isoladas da único-pilha da purificação magnética. Para análise de FACS, bloqueie as células com bloqueador de FC CD16/CD32 (tabela de materiais) antes de se manchar com anticorpos contra marcadores superficiais ou intracelulares. 5. análise de citometria de fluxo Coloração e análise de superfície celular Resuspend 5-10 × 105 células isoladas da lâmina própria em 50 ml de tampão FACS (1% BSA, 2 mm EDTA em PBS, pH 7,4). Incubar células com anti-mouse CD16/CD32 (tabela de materiais) em uma diluição 1:50 para bloquear receptores FC no gelo por 10 min. Lave as células com 500 μL de tampão FACS gelado para remover o anti-CD16/CD32 não acoplado antes da coloração da célula-superfície. Suspensões colónicas da único-pilha da mancha de superfície (106 Cells/50 ml) com o anticorpo fluorescente-etiquetado na diluição 1:100 no gelo por 30 minutos para avaliar a propria Colônica do lamina. Lave as células rotuladas com 500 μL de tampão FACS gelado duas vezes para remover anticorpos não acoplados. Analise células mononucleares rotuladas por citometria de fluxo. Portão para viver, então para FSC+SSC+ seguido por CD11b+ Cx3Cr1+e, em seguida, analisar outros marcadores de ativação de macrófago, incluindo mhcii, CD80, CD86 e CD40. Coloração e análise de citocinas intracelulares Para a coloração de citocinas intracelulares, fixar e permeabilizar as células manchadas de superfície usando um kit de solução de fixação/permeabilização (tabela de materiais); por favor, siga as instruções do fabricante para obter etapas detalhadas. Pilhas da lâmina própria da porta para vivo, então para FSC+SSC+ seguido por CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ para detectar o nível intracelular de IL23 citocinase CD11b + Cx3Cr1 + IL1β+ a detectam níveis intracelulares de citocinas IL1β. coloração e análise de αSMA Lave as células com tampão FACS duas vezes por centrifugação a 200 x g e 4 ° c por 5 min para remover o excesso de tampão fixador. Para determinar o nível αSMA, permeabilize as células com um kit de solução de fixação/permeabilização (tabela de materiais). Incubar células com anticorpo anti-αSMA-AF488 (tabela de materiais) usando 1:1000 de diluição no gelo por 30 min. Lave as células duas vezes e, em seguida, fazer análise FACS. Portão para Live, FSC+SSC+ seguido pela detecção de αsma+ células em células colônicas. 6. isolação do RNA, RT-PCR, PCR do tempo real Isolar o RNA de MACS ou FACS células purificadas ou cólon extirpado tecido homogeneizando-os em reagente de extração (tabela de materiais).Nota: Use óculos de segurança e outros equipamentos de proteção de laboratório ao trabalhar com este reagente, pois é um irritante do pulmão e da pele. Trabalhe com segurança em um capô. Adicionar 0,5 μL de glicogênio livre de RNase de 20 μg/mL de solução de glicogênio (tabela de materiais) para melhorar a recuperação do RNA total antes da precipitação do RNA com isopropanol. Ressuscitem o RNA pellet em 50 μL de água livre de RNase (tabela de materiais) e incubar a 55 ° c por 5 min para dissolver completamente o palato de RNA. Leia as concentrações de RNA utilizando um espectrofotômetro a 260 nm. Sintetizar cDNA usando 1 μg de RNA total e um kit de síntese de transcrição reversa (tabela de materiais). Analise a expressão gênica usando 2 μL de cDNA como modelos via PCR em tempo real. Use um 96-bem PCR placa qPCR Master Mix Kit (tabela de materiais). Use os valores de TC para calcular a mudança de dobra da abundância de RNA após normalizar os valores de GAPDH/HPRT. 7. western blotting Tecido de cólon lise usando tampão de Lise RIPA (1% NP40). Resolva o lisado da proteína em um gel de bis-Tris de 8% em uma tensão constante de 80 V. Transferência de gel-proteína para membrana de nitrocelulose (s) em tampão de transferência a frio rodando a uma corrente constante de 50 mA para 2 h a 4 ° c. Bloquear regiões não específicas na membrana transferida de proteínas utilizando 5% de leite não gordo em TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0, 5% Tween-20) durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente. Para detectar níveis de αSMA, incubar membrana (s) com anticorpo de detecção primária αSMA a 4 ° c durante a noite. Lave as membranas 3-4 vezes usando TBST em intervalos de 15 min. Incubar com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:10000) em 5% de leite não gordo em TBST. Desenvolva membranas usando um kit de desenvolvimento ECL. Normalize intensidades do sinal da proteína com GAPDH como um controle do carregamento para a análise da densitometria. 8. análise estatística Analise os dados usando o software de análise de dados de escolha, comparando entre o tipo selvagem e animais KO. Considerar o valor de P de < 0,05 para ser significante (* P < 0, 5; * * P < 0, 1; * * * P < 0, 1). Use o teste t de Student para testar as diferenças entre dois grupos e o teste ANOVA para análise entre mais de dois grupos.