对TNBS介导肠纤维化发展的力学洞察与拉帕霉素抑制作用的评价

对于这份手稿，所有人类样本都是根据研究所审查委员会（IRB）和奥尔巴尼医学院人类研究委员会批准的议定书采购的。所有涉及动物的研究都严格按照奥尔巴尼医学院机构动物护理和使用委员会以及国家卫生研究院关于护理和使用实验室动物的指南批准的协议进行. 1. 收集人类肠道标本 根据该机构的研究委员会协议收集人体组织样本。 从没有 IBD 病史的患者身上获取诊断为纤维化的 CD 患者的肠道组织（结肠）。 使用部分肠道组织进行免疫组织学，将组织的另一部分用于分析mRNA，以及纤维化和细胞因子基因/标记蛋白表达的最后一部分。 对于免疫组织学分析，首先将人体组织样本固定在4%的甲醛中至少48小时，然后将其转移到含有70%乙醇的管中至少16小时。使用组织-微托姆的部分。 使用刷子，轻轻地将玻璃滑块上每个切割部分铺开，以便进行染色。 染色组织部分滑动与三铬染色检测胶原蛋白沉积，并与βSMA染色检测肌纤维细胞（见第3节有关三铬和βSMA染色的详细信息）。在光学显微镜下检查染色部分。 处理获得人体组织样本的另一部分，使蛋白质解结酶通过西斑检测βSMA（有关西方斑点分析的详细信息，见第7节）。 使用提取试剂（材料表）从人体组织样本的最后部分获取RNA，并通过RT-PCR将mRNA转化为cDNA。 通过 qPCR 分析纤维化和细胞因子基因（有关 mRNA 制备的详细信息，请参阅第 6 节）。 2. 小鼠TNBS纤维化和拉帕霉素治疗的诱导 根据机构批准的动物研究规程进行动物研究。 在颈部区域周围切下成年小鼠，以便通过皮肤接触对TNBS进行预敏。将 TNBS 浸泡在棉签中，然后将 TNBS 涂抹到小鼠颈部的被扫描区域。注：预敏化是一个非常重要的步骤，因为它改善延迟超敏反应，以启动TNBS介导的炎症。 敏感后8天，每周一次，每周一次，为期六周，通过直肠内给政治疗诱发结肠炎。通过连接到3.5法国聚氨酯导管的1mL注射器，使用100μL灌肠，使用4毫克TNBS（在25%乙醇中），仅给对照小鼠100μL25%乙醇。 在TNBS给内，用五巴比妥（25毫克/千克腹内）麻醉小鼠，或将其暴露于2.5%的亚氟兰，以及1升/分钟的氧气。通过轻轻捏脚趾和寻找没有反射来确认麻醉。 在小鼠麻醉时，使用眼睛上的兽医药膏来防止干燥。 每周一周向对照和TNBS治疗的小鼠注射2mg/kg/天或车辆（5%补间-20和4%乙醇），持续3-6周，内腹炎。 使用6周TNBS经过治疗的小鼠肠道分析细胞外测定，包括成科、流式细胞测定、西印和RNA提取。为了收获器官，使用CO2吸入对小鼠实施安乐死，并确认宫颈脱位安乐死。 为了收获器官，使用CO2吸入对小鼠实施安乐死，并确认宫颈脱位安乐死。安乐死后，用手术级剪刀和钳子纵向打开小鼠的腹腔侧。从直肠中取出整个结肠到终端的二聚体区域。快速将结肠转移到冰冷的 1x HBSS，并使用相同的缓冲液清洗结肠。 测量和比较对照和TNBS处理小鼠的结肠长度。尽可能快地执行此步骤，以避免结肠干燥，以避免细胞死亡。 将结肠切成小块，并保持在-80°C，以储存，以用于将来（RNA/西斑分析）。使用另一个冒号进行 FACS 分析。 一定要从对照和TNBS处理的动物结肠的类似区域切块和收集结肠组织样本。注：TNBS接种可预期死亡率为10%-20%，但经验可显著降低死亡率。 3. 肠道纤维化的免疫组织病理学评估 将人和/或小鼠组织固定在4%的甲醛中48小时，然后转移到70%乙醇16小时。注：甲醛是一种神经毒性化学物质，因此避免吸入;使用面罩时使用。 石蜡嵌入固定结肠组织，切片至5μm厚度，并直接将组织放在玻璃玻片上，用于组织学。 根据制造商的说明执行 H&E 和三铬蓝色染色，以检测胶原蛋白。 简单地说，首先将包含截面的幻灯片浸入两室的两室中，在每个腔室中浸解5分钟。 用100%酒精冲洗幻灯片1分钟;重复此步骤三次。用自来水再次冲洗1分钟。 之后，在56°C的预热布恩溶液中浸泡幻灯片60分钟。布恩的溶液外观为黄色;在自来水中从布恩溶液中拿出幻灯片3分钟后洗净，或直到幻灯片变成无色。 在室温下将幻灯片浸入改性迈尔的血氧林溶液中 7 分钟。 在Trichrome染色中浸泡5-8分钟，将幻灯片浸入三铬污渍中5-8分钟。立即在自来水中冲洗幻灯片5-10秒，以去除多余的Trichrome污渍。 脱水幻灯片与100%酒精1分钟。重复这个程序三次。 用二甲苯清除幻灯片 1 分钟，然后重复步骤 3 倍。 使用安装介质安装滑轨 （材料表）。 小心地用钳子将盖玻片握住，使其覆盖整个部分，而不会有任何气泡。如果有气泡，请点击盖玻片快速去除气泡。 使用免疫染色检测βSMA。 在室温下阻塞缓冲液（0.2%Triton X-100 和 5% 正常山羊血清，在 1x PBS 中）中阻塞结肠部分 1 小时。 在4°C过夜的4°C下，在滑道溶液（0.2%Triton X-100和3%正常山羊血清）上孵育100μL稀释原抗体的βSMA（材料表）。 用 1x PBS 洗涤部分三次。 使用山羊抗小鼠IgG （H + L）与Alexa荧光488（材料表）结合作为二级抗体在室温下2小时。 用 1x PBS 洗涤部分三次。 使用 DAPI 对原子核进行 5 分钟的抗污。 用 1x PBS 洗涤部分三次。 用荧光安装介质安装滑梯（材料表），并用指甲油盖玻片密封。 使用LSM 880共聚焦显微镜采集图像，并使用显微镜软件处理图像。 使用 ImageJ 在同一节中平均拍摄多个选定区域，从而量化图像。 4. 分离肠道拉皮纳普氏体和纯化Cx3Cr1+单核吞噬细胞 纵向打开冰冷的汉克平衡盐溶液（HBSS;材料表）用同样的缓冲液清洗结肠。 在 HBSS 中使用无菌剪刀切割约 5 厘米小结肠组织。 在含有10 mL预消化缓冲液的50 mL锥形管中转移小结肠组织片（1x HBSS，带5S、5 mM EDTA和1 mM DTT），在37°C培养箱11中，在100rpm下摇动20分钟。注：在100rpm摇动条件下，在37°C中孵育结肠组织，允许有效的胶原酶组织消化和高产活细胞。 通过40μm细胞过滤器，丢弃分离的结肠上皮。 从滤网中收集剩余的组织，并在消化缓冲液中进一步消化，其中含有胶原酶IV型和DNase I（材料表），在1xHBSS中，在37°C的转速100rpm下，用5S进行20分钟。 涡旋消化组织约20秒，并通过40μm细胞过滤器获得拉米纳普氏菌分。 在 4°C 中，将层皮基球分在 700 x g下颗粒 要从拉米纳基里亚中排除死细胞，请使用密度梯度（材料表）。注：此处使用的密度梯度介质（材料表）可能导致单核细胞的丢失;然而，它极大地去除了制备中的死细胞，这整体上提高了纯度。 在 30% 和 70% 密度梯度介质解决方案中，每个解决方案均生产 100 mL。在 30% 溶液的 10 mL 中重新悬浮获得的细胞，并在 15 mL 管中覆盖在 70% 溶液的 5 mL 之上。 在 1，000 x g和室温下，在无制动器条件下将梯度离心。收集含有拉米纳普拉姆细胞的白色环相，这将在30%和70%梯度层之间。 在冰冷的HBSS中重新悬浮和在500 x g、20°C下离心机10分钟洗涤获得的细胞。 在FACS（荧光活性细胞分选）缓冲液（PBS，pH 7.4，1%BSA和2 mM EDTA）中重新悬浮细胞。 使用磁珠和/或FACS分拣从收集的细胞中纯化单核噬细胞。 磁性净化 在用抗体染色之前，使用抗小鼠CD16/CD32 Fc阻滞剂孵育层皮质细胞的第一块细胞表面在冰上孵育15分钟。 用抗Cx3Cr1-PE（纤维素）抗体与抗PE微珠（材料表）在冰上孵育细胞30分钟，以捕获结合的细胞。使用 FACS 缓冲液清洗细胞。 通过磁场中的磁性激活细胞分拣柱将抗体/珠结合细胞传递，以去除未结合的细胞。使用 FACS 缓冲液洗涤三次。从磁场中取出柱，并推入柱塞，以产生珠约束单元。 FACS 排序注：FACS分拣可用于代替磁性净化。尽管磁纯化是一种简单且经济高效的方法，但它仅限于纯化单个细胞，而不是细胞亚群。因此，为了分离细胞的亚群，FACS排序方法是对单个细胞以及细胞子群进行排序的有效方法。 使用抗小鼠 CD16/CD32 Fc 阻滞剂 （材料表） 阻止拉米纳基里亚细胞。 通过用抗CD64、CD11c、CD11b、Cx3Cr1、Ly6C和MHCII抗体孵育染色细胞。 使用 FACS 流式细胞仪进行排序，对 CD11c-CD64 + CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C-细胞进行门控，以纯化 CX3Cr1 （P3 + P4） 总体。 Lyse 对细胞进行总RNA制备，并检测细胞因子和纤维化标记（参见RNA和cDNA制备第6节）。 分析纤维化标记物的mRNA表达和从磁性纯化分离的单细胞悬浮液的炎症细胞因子分析。 对于FACS分析，在用抗体对表面或细胞内标记染色之前，用抗小鼠CD16/CD32Fc阻滞剂（材料表）阻断细胞。 5. 流式细胞分析 细胞表面染色和分析 在 50 mL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮 5-10 × 105分离的拉米纳普列菌细胞（1% BSA，PBS 中的 2 mM EDTA，pH 7.4）。 用抗小鼠CD16/CD32（材料表）孵育细胞，以1：50稀释，将Fc受体在冰上阻断10分钟。 使用 500 μL 的冰冷的 FACS 缓冲液清洗细胞，以去除细胞表面染色前的未结合抗 CD16/CD32。 表面染色结肠单细胞悬浮液（106细胞/50 mL），在1：100稀释冰上1：100稀释30分钟，以评估结肠拉米纳普氏菌。 用500μL的冰冷的FACS缓冲液清洗标记的细胞两次，以去除未结合的抗体。 通过流式细胞测定法分析标记的单核细胞。门为实时，然后为FSC+SSC+其次是CD11b+ Cx3Cr1+，然后分析其他巨噬菌体激活标记，包括MHCII，CD80，CD86和CD40。 细胞内细胞因子染色和分析 对于细胞内细胞因子染色，使用固定/渗透溶液套件（材料表）修复和渗透表面染色的细胞;请按照制造商的说明了解详细步骤。 门拉皮纳蛋白酶细胞用于活，然后用于FSC+SSC+后跟CD11b+ Cx3Cr1+IL23+检测IL23细胞因子和CD11b的细胞内水平= Cx3Cr1+IL1+检测IL1+细胞因子的细胞内水平。 *SMA 染色和分析 用FACS缓冲液洗涤细胞两次，在200 x g和4°C下离心5分钟，以去除多余的固定缓冲液。 要确定βSMA水平，使用固定/渗透溶液套件（材料表）渗透细胞。 用抗βSMA-AF488抗体（材料表）孵育细胞，在冰上稀释1：1，00030分钟。 洗涤细胞两次，然后做FACS分析。活门，FSC+SSC=然后检测结肠细胞中的βSMA+细胞。 6. RNA分离，RT-PCR，实时PCR 通过在萃取试剂中将其同质化，从MACS或FACS纯化细胞或结肠切除组织中分离RNA（材料表）。注意：使用此试剂时，请使用安全护目镜和其他实验室防护装备，因为它是肺部和皮肤刺激物。在引擎盖中安全地工作。 从20μg/mL糖原库存溶液（材料表）中加入0.5μL的无RN酶糖原，以改善在用异丙醇沉淀RNA之前总RNA的恢复。 将RNA颗粒重新悬浮在50μL的RNase自由水（材料表）中，并在55°C孵育5分钟，以完全溶解RNA味觉。 使用 260 nm 的分光光度计读取 RNA 浓度。 使用1μg总RNA和逆转录合成试剂盒合成cDNA（材料表）。 通过实时PCR分析使用2μL的cDNA作为模板的基因表达。使用 96 孔 PCR 板 qPCR 主混合套件 （材料表）。在GAPDH/HPRT值正常化后，使用CT值计算RNA丰度的折叠变化。 7. 西方印迹 使用RIPA裂液缓冲液（1%NP40）进行裂化结肠组织。 在80V的恒定电压下，在8%的二元凝胶中分解蛋白质解乳酸。 在冷转移缓冲液中将凝胶蛋白转移到硝化纤维素膜，在4°C下以50 mA的恒定电流运行2小时。 在TBST（25 mM Tris-HCl，pH7.4，1.5M NaCl，0.05%补间-20）下，使用5%的脱脂牛奶在TBST中阻断蛋白质转移膜上的非特定区域，在室温下至少1小时。 为了检测βSMA水平，在4°C过夜时用βSMA原发检测抗体孵育膜。 每隔15分钟使用TBST清洗膜3-4次。 在TBST的5%非脂牛奶中用HRP结合的二级抗体（1：10，000）孵育。 使用 ECL 开发套件开发膜。 使用 GAPDH 使蛋白质信号强度标准化，作为密度分析的载荷控制。 8. 统计分析 通过比较野生动物和KO动物，利用所选择的数据分析软件分析数据。 将 <0.05 的 P 值视为显著值（*P < 0.05;+P < 0.01;+P < 0.01）。 使用学生 t 检验测试来测试两组之间的差异，而 ANOVA 测试则用于分析两组以上组之间的差异。