TNBS 중재장 섬유증의 발달에 기계론적 통찰력 과 라파마이신의 억제 효과 평가

이 원고에 대 한, 모든 인간의 샘플 연구소 검토 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 조달 되었다 (IRB) 그리고 알바니 의과 대학에서 인간 연구위원회에 의해. 동물과 관련된 모든 연구는 알바니 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회뿐만 아니라 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 엄격하게 수행되었습니다. . 1. 인간의 장 표본의 수집 기관의 연구위원회 프로토콜에 따라 인간 조직 샘플을 수집합니다. 섬유증으로 진단된 CD 환자의 장 조직(ileocolonic)을 조달하고 IBDs의 병력이 없는 환자로부터 샘플을 제어합니다. 면역학을 위한 장 조직의 부분, mRNA를 분석하기 위한 조직의 또 다른 부분 및 섬유성 및 사이토카인 유전자/마커의 단백질 발현을 위한 마지막 부분을 사용하십시오. 면역학 분석을 위해, 먼저 적어도 48 시간 동안 4% 파라포름알데히드에 인간 조직 견본을 고치고 적어도 16 시간 동안 70% 에탄올을 포함하는 관으로 옮김을 옮기십시오. 조직 마이크로토메를 사용하여 단면도를 사용한다. 브러쉬를 사용하여 유리 슬라이드의 각 컷 부분을 부드럽게 펴서 얼룩을 냅니다. 얼룩 조직 섹션 슬라이드 콜라겐 침착을 감지 하기 위해 trichrome 얼룩, 그리고 αSMA 얼룩 myofibroblasts를 감지 하기 위해 (참조 섹션 3 삼조 및 αSMA 염색에 대 한 자세한 내용은 참조). 가벼운 현미경으로 염색된 부분을 검사합니다. 수득된 인간 조직 샘플의 또 다른 부분을 처리하여 단백질 용해하여 서쪽 얼룩을 통해 αSMA를 검출합니다(웨스턴 블롯 분석에 대한 자세한 내용은 섹션 7 참조). 추출 시약(재료 표)을사용하여 인간 조직 샘플의 최종 부분에서 RNA를 얻고 RT-PCR을 통해 mRNA를 cDNA로 변환합니다. qPCR에 의하여 섬유성 및 사이토카인 유전자를 분석합니다(mRNA 준비에 대한 자세한 내용은 섹션 6 참조). 2. 마우스에서 TNBS 섬유증 및 라파마이신 치료의 유도 기관에서 승인한 동물 연구 프로토콜에 따라 동물 연구를 수행합니다. 진피 노출을 통해 TNBS에 미리 과민화하기 위하여 목 지역 의 주위에 성숙한 마우스를 면도하십시오. 면봉에 TNBS를 담근 다음 TNBS를 마우스 넥의 면도 부위에 바하십시오.참고: TNBS 매개 염증을 개시하기 위하여 연기한 과민반응을 향상하기 때문에 사전 과민반응은 아주 중요한 단계입니다. 8 일 사전 과민성, 6 주 동안 일주일에 한 번 직장 내 투여에 의해 대장염을 유도. 3.5 프렌치 폴리우레탄 카테터에 부착된 1 mL 주사기를 통해 100 μL 관장내를 사용하여 TNBS(25% 에탄올내)의 4 mg을 적용하고 대조군 마우스에게 25% 에탄올만 100 μL을 준다. 펜토바르비탈(25 mg/kg 복막)으로 마우스를 마취하거나 TNBS 투여 중 산소 1L/min과 함께 2.5% 이소플루란에 노출시다. 발가락을 부드럽게 꼬집고 반사가 없는 것을 찾아 마취를 확인하십시오. 쥐가 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의 연고를 사용합니다. 라파마이신을 2 mg/kg/day 또는 비히클(5% 트웬-20 및 4% 에탄올)에 매주 평일 3-6주 동안 주입하여 복강 내, 대조군 및 TNBS 처리 마우스모두에 주입합니다. 6주 TNBS 후 처리된 마우스 장에서 조직학, 유세포 분석, 서부 블로팅 및 RNA 추출을 포함한 세포외 분석방법을 분석합니다. 장기를 수확하기 위해CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 안락사를 확인하십시오. 장기를 수확하기 위해CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 안락사를 확인하십시오. 안락사 후 수술용 가위와 집게를 사용하여 복부 쪽에 마우스를 세로로 엽니다. 직장에서 말단 일륨 부위까지 결장 전체를 제거하십시오. 결장재를 얼음으로 차가운 1x HBSS로 빠르게 옮기고 동일한 버퍼를 사용하여 결장세척하십시오. 대조군 및 TNBS 처리 마우스의 결장 길이를 측정하고 비교한다. 세포 사망을 피하기 위해 결장밖으로 건조하지 않도록 가능한 한 빨리이 단계를 수행하십시오. 결장을 작은 조각으로 자르고 미래의 목적을 위해 -80 °C에서 보관하십시오 (RNA / 서쪽 얼룩 분석). FACS 분석을 위해 결장의 다른 부분을 사용합니다. 절단 하 고 제어 및 TNBS 처리 동물의 결장의 유사한 지역에서 결 장 조직 샘플을 수집 해야 합니다.참고: TNBS 접종으로 10%-20%의 사망률이 예상되지만 경험으로는 사망률이 현저히 감소할 수 있습니다. 3. 장 섬유증의 면역 조직 병리학 평가 인간 및/또는 마우스 조직을 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 16시간 동안 70% 에탄올로 옮김을 합니다.참고 : 파라 포름 알데히드는 신경 독성 화학 물질이므로 흡입을 피하십시오. 사용하는 동안 얼굴 마스크를 사용하십시오. 파라핀은 고정 된 결장 조직을 포함하고 5 μm 두께로 슬라이스하고 조직학을 위해 유리 슬라이드에 직접 조직을 놓습니다. 콜라겐을 검출하기 위해 제조업체의 지침에 따라 H&E 및 트라이크롬 블루 염색을 수행합니다. 간단히, 먼저 각 챔버에서 5 분 동안 자일렌의 두 챔버에 포함 된 섹션을 포함하는 슬라이드를 침수하여 섹션을 분리. 1 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 헹구십시오. 이 단계를 세 번 반복합니다. 수돗물로 다시 1분 동안 헹구십시오. 그 후, 60 분 동안 56 °C에서 예열 된 Bouin의 용액에 슬라이드를 담그십시오. 3 분 동안 또는 슬라이드가 무색이 될 때까지 수돗물에 Bouin의 용액에서 슬라이드를 복용 한 후 씻어. 실온에서 7분 동안 수정된 메이어의 헤마톡실린 용액에 슬라이드를 담그십시오. 5-8 분 동안 트리크롬 얼룩에 침지하여 얼룩 슬라이드. 즉시, 여분의 트리크롬 얼룩을 제거하기 위해 5-10s에 대한 흐르는 물에 슬라이드를 헹구십시오. 1 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 탈수하십시오. 자일렌으로 슬라이드를 1분 동안 지우고 3x 단계를 반복합니다. 장착 매체가 있는 슬라이드를 장착합니다(재료표). 포셉으로 한쪽 끝에 커버 슬립을 조심스럽게 잡고 거품없이 전체 섹션을 덮도록하십시오. 거품이 있는 경우 커버슬립을 눌러 거품을 빠르게 제거합니다. αSMA를 검출하기 위해 면역 염색을 사용하십시오. 실온에서 1시간 동안 차단 완충제(0.2% 트리톤 X-100 및 1x PBS에 5% 정상 염소 혈청)에서 결장 부분을 차단합니다. 슬라이드 용액에 αSMA(재료 표)에대한 희석 된 1 차 항체 100 μL로 배양 (0.2 % 트리톤 X-100 및 1 x PBS에서 3 % 정상 염소 혈청; 항 αSMA 1:200)에서 밤새 4 °C. 1x PBS로 섹션을 세 번 씻으소서. 실온에서 2시간 동안 이차 항체로서 알렉사 플루어 488(물자표)과접합된 염소 항 마우스 IgG(H+L)를 사용한다. 1x PBS로 섹션을 세 번 씻으소서. DAPI를 사용하여 5분 동안 핵을 염색합니다. 1x PBS로 섹션을 세 번 씻으소서. 형광 마운팅 매체(재료 표)로슬라이드를 장착하고 매니큐어를 사용하여 커버 슬립으로 밀봉하십시오. LSM 880 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득하고 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. ImageJ를 사용하면 동일한 섹션에서 선택한 여러 영역의 평균을 취하여 이미지를 정량화합니다. 4. 장 내 라미나 프로피아의 분리 및 Cx3Cr1+ 단핵 식세포의 정제 얼음 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션 (HBSS)에서 결장열립니다. 재료 표) 동일한 버퍼로 콜론을 세척하십시오. HBSS에서 멸균 가위를 사용하여 결장 조직의 약 5cm 작은 조각을 잘라. 10 mL의 사전 소화 완충액(5% FBS, 5 mM EDTA 및 1 mM DTT를 함유한 1x HBSS)을 함유하는 50 mL 원엽 튜브에 작은 결장 조직 조각을 옮기고, 37°C 인큐베이터11에서100 rpm에서 20분 동안 흔들어.참고 : 100 rpm 흔들림 상태에서 37 °C에서 대장 조직을 배양하면 효율적인 콜라게 나아제 조직 소화와 생존 가능한 세포의 높은 수율을 허용합니다. 40 μm 세포 여과기를 통과하여 분리 된 대장 상피를 폐기하십시오. 여비과기로부터 남은 조직을 수집하고 콜라게나아제 타입 IV 및 DNase I(물질표)를함유하는 소화 완충액에서 추가로 소화하고 100 rpm에서 37°C에서 20분 동안 5% FBS로 1x HBSS를 함유한다. 약 20 s에 대 한 소화 된 조직 소용돌이 및 40 μm 세포 여과기를 통과 하 여 라미나 프로피아 분획을 얻을 수 있습니다. 4 °C에서 700 x g에서 세포를 펠렛에 라미나 프로프리아 분획을 원심 분리기 라미나 프로피아에서 죽은 세포를 제외하려면 밀도 그라데이션(재료표)을사용한다.참고 : 여기에 사용되는 밀도 구배 매체(재료 표)는단핵 세포의 손실을 일으킬 수 있습니다. 그러나, 그것은 크게 준비에서 죽은 세포를 제거, 이는 전반적인 순도를 증가. 각각 30% 및 70% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션을 100mL로 만듭니다. 30% 용액의 10 mL에서 얻은 세포를 재중단하고 15 mL 튜브에서 70% 용액의 5 mL 위에 오버레이한다. 1,000 x g 및 실온에서 브레이크가 없는 상태에서 그라데이션을 원심분리합니다. 30 % 및 70 % 그라데이션 층 사이에있을 것이다 라미나 프로피아 림프구를 포함하는 흰색 링 상을 수집합니다. 500 x g,20 °C에서 얼음 차가운 HBSS 및 원심 분리기를 다시 일시 중단하여 얻은 세포를 10 분 동안 FACS (형광 활성화 세포 선별) 버퍼 (PBS, pH 7.4, 1 % BSA 및 2 mM EDTA)에서 세포를 다시 일시 중단하십시오. 자기 비드 및 / 또는 FACS 선별을 사용하여 수집 된 세포에서 단핵 식세포를 정화합니다. 자기 정화 항체로 염색하기 전에, 제1 블록 세포 표면을 얼음에 15분 동안 항마우스 CD16/CD32 Fc 차단제로 인큐베이팅하여 라미나 프로피아 세포의 표면을 배양하였다. 항-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) 항체와 함께 항 PE 마이크로 비드(재료 표)를얼음에 30 분 동안 배양하여 경계 세포를 포획합니다. FACS 버퍼로 세포를 씻으하십시오. 자기장의 자기 활성화 세포 정렬 컬럼을 통해 항체/비드 경계 세포를 통과하여 언바운드 셀을 제거합니다. FACS 버퍼로 세 번 씻으시고 세탁하십시오. 비드 바운드 셀을 생성하기 위해 컬럼의 자기장 및 푸시 플런저에서 컬럼을 제거합니다. FACS 정렬참고 : FACS 정렬은 자기 정화 대신 사용할 수 있습니다. 자기 정화는 쉽고 비용 효율적인 방법이지만, 세포의 하위 집단이 아닌 단일 세포를 정화하는 것으로 제한됩니다. 따라서, 세포의 하위 모집단을 분리하기 위해, FACS 정렬 방법은 세포의 하위 집단뿐만 아니라 단일 세포를 정렬하는 효과적인 방법이다. 안티 마우스 CD16 / CD32 Fc 차단제(재료의 표)와블록 라미나 프로프리아 셀. 항 CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C 및 MHCII 항체로 배양하여 세포를 얼룩. CX3Cr1(P3+ P4) 모집단을 정화하기 위해 FACS 유동 세포계를 사용하여, CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C에 대한 게이팅을 정렬한다. 총 RNA 제제를 위한 Lyse 분류된 세포를 검출하고 사이토카인 및 섬유성 마커를 검출합니다(RNA 및 cDNA 제제에 대한 섹션 6 참조). 자기 정제로부터 분리된 단세포 현탁액으로부터 섬유성 마커 및 염증성 사이토카인 분석의 mRNA 발현을 분석한다. FACS 분석을 위해, 표면 또는 세포 내 마커에 대하여 항체로 염색하기 전에 반대로 마우스 CD16/CD32 Fc 차단제(물자의 표)를가진 세포를 막습니다. 5. 유세포 분석 세포 표면 염색 및 분석 FACS 완충액 의 50 mL에서 5-10 × 105 단리 라미나 프로피아 세포를 다시 일시 중단하십시오 (1 % BSA, PBS에서 2 mM EDTA, pH 7.4). 반대로 마우스 CD16/CD32(재료의 표)를가진 세포를 1:50 희석하여 얼음에 있는 Fc 수용체를 10분 동안 차단합니다. 500 μL의 얼음 차가운 FACS 버퍼로 세포를 세척하여 세포 표면 염색 전에 언바운드 안티 CD16/CD32를 제거합니다. 표면 얼룩 결장 단세포 현탁액 (106 세포 / 50 mL) 형광 표지 항체와 얼음에 1:100 희석 30 분 대장 라미나 프로프리아를 평가. 500 μL의 얼음 차가운 FACS 버퍼로 표지 된 세포를 두 번 씻어 언바운드 항체를 제거하십시오. 유세포분석에 의해 표지된 단핵 세포를 분석한다. 라이브 게이트, 다음 FSC+SSC+ CD11b+ Cx3Cr1+다음에, 다음 MHCII, CD80, CD86 및 CD40을 포함한 다른 대식세포 활성화 마커를 분석합니다. 세포내 사이토카인 염색 및 분석 세포내 사이토카인 염색의 경우, 고정/퍼메아빌화 용액키트(재료 표)를사용하여 표면 염색 된 세포를 수정하고 투과화하십시오. 자세한 내용은 제조업체의 지침을 따르십시오. 라이브용 게이트 라미나 프로피리아 셀, FSC+SSC+에 이어 CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ IL23 의 세포 내 수준을 검출하여 IL23 사이토카인 및 CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ IL1β 사이토카인의 세포내 수준을 검출합니다. αSMA 염색 및 분석 FACS 버퍼로 세포를 200 x g 및 4°C에서 원심분리하여 5분 동안 세척하여 과도한 고정 버퍼를 제거합니다. αSMA 레벨을 결정하려면 고정/퍼메아빌화 솔루션키트(재료 표)로셀을 투과합니다. 항 αSMA-AF488 항체(재료표)로세포를 배양하여 얼음에 1:1,000 희석을 사용하여 30 분 동안. 세포를 두 번 세척한 다음 FACS 분석을 수행합니다. 라이브, FSC+SSC+에 대한 게이트는 콜로닉 세포에서 αSMA+ 세포의 검출에 의해 뒤따릅니다. 6. RNA 절연, RT-PCR, 실시간 PCR MACS 또는 FACS 정제 세포 또는 결장 절제 조직을 추출 시약에서 균질화하여 RNA를 분리합니다(재료표).참고: 폐와 피부 자극제이기 때문에 이 시약으로 작업할 때는 안전 고글과 기타 실험실 보호 장비를 사용하십시오. 후드에서 안전하게 작업할 수 있습니다. 20 μg/mL 글리코겐 스톡 솔루션(표)에서 RNase-free 글리코겐 0.5 μL을 첨가하여 RNA를 이소프로판올로 침전시키기 전에 총 RNA의 회수를개선합니다. RNA 펠릿을 RNase 자유물(재료표)의50 μL에서 다시 중단하고 55°C에서 5분 동안 배양하여 RNA 구개를 완전히 용해시다. 260 nm에서 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 읽습니다. 총 RNA 1 μg 및 역전사 합성키트(물자 표)를사용하여 cDNA를 합성한다. 실시간 PCR을 통해 cDNA의 2 μL을 템플릿으로 사용하여 유전자 발현을 분석합니다. 96웰 PCR 플레이트 qPCR 마스터 믹스키트(재료 표)를사용하십시오. CT 값을 사용하여 GAPDH/HPRT 값을 정규화한 후 RNA 풍부도의 배 변화를 계산합니다. 7. 웨스턴 블로팅 RIPA 용해 완충액을 사용하여 결장 조직을 용해 (1% NP40). 80V의 일정한 전압에서 8% 비스-트리스 젤로 단백질 을 풀어주세요. 4°C에서 2시간 동안 50 mA의 일정한 전류에서 실행되는 차가운 전달 완충액에서 겔 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮김을 전달합니다. TBST에서 5% 비지방 우유(25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% 트위엔-20)를 사용하여 실온에서 적어도 1시간 동안 단백질 이송막상에서 비특이적 영역을 차단한다. αSMA 수준을 검출하기 위해, αSMA 1차 검출 항체를 밤새 4°C에서 배양한다. 15 분 간격으로 TBST를 사용하여 멤브레인을 3-4 회 씻으하십시오. TBST에서 5% 무지방 우유에 HRP-컨쥬게이트 이차 항체(1:10,000)로 배양합니다. ECL 개발 키트를 사용하여 멤브레인을 개발합니다. 고밀도 분석 분석을 위한 로딩 제어로서 GAPDH로 단백질 신호 강도를 정상화합니다. 8. 통계분석 야생형과 KO동물을 비교하여 선택한 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석합니다. P 값 (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)을 고려하십시오. Student의 t 검정을 사용하여 두 그룹 간의 차이를 테스트하고 두 그룹 이상의 분석을 위해 ANOVA 테스트의 차이점을 테스트합니다.