クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法
概要
この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。
Abstract
クロマチンドメインの組織および構造は、個々の細胞系統に固有である。彼らの誤った規制は、細胞同一性および/または病気の損失につながる可能性があります。多大な努力にもかかわらず、クロマチンドメインの形成と伝播に関する我々の理解は依然として限られている。クロマチンドメインは、確立中の最初の事象に従うことを助長しない定常状態条件下で研究されている。ここでは、クロマチンドメインを誘導的に再構築し、時間の関数として再形成する方法を提示する。しかし、最初にPRC2媒介性抑圧クロマチンドメイン形成の場合に適用されるが、それは容易に他のクロマチンドメインに適応することができる。この方法をゲノミクスおよびイメージング技術と組み合わせることで、クロマチンドメインの確立を詳細に研究する貴重なツールが提供されます。この方法は、クロマチンドメインがどのように形成され、相互作用するかについての我々の理解に革命をもたらすと信じています。
Introduction
真核生物ゲノムは高度に組織化されており、クロマチンアクセシビリティの変化は遺伝子転写1を直接制御する。ゲノムには、転写活性および複製タイミング2、3と相関する異なるタイプのクロマチンドメインが含まれている。これらのクロマチンドメインのサイズは数キロベース(kb)から100kb以上の範囲であり、異なるヒストン修飾4の濃縮によって特徴付けられます。中心的な問題は、これらのドメインがどのように形成され、どのように伝播されるかということです。
最もよく特徴付けられたクロマチンドメインの1つは、ポリコム抑圧複合体2(PRC2)の活性を通じて促進される。PRC2は、タンパク質5、6のポリコムグループ(PcG)のサブセットで構成されるマルチサブユニット複合体であり、ヒストンH3(H3K27me1/me2/me3)7、8、リジン27のモノ、ディ、トリメチル化を触媒する。 9,10.H3K27me2/me3は抑圧的なクロマチン状態に関連しているが、H3K27me1の機能は不明6,11である。PRC2のコアコンポーネントの1つである胚性エクトダーム開発(EED)は、その芳香族ケージを介してPRC2触媒、H3K27me3の最終産物に結合し、この特徴はPRC212、13のアロステリック刺激をもたらす。PRC2酵素活性は、特定の系統に対して禁忌である特定の発達遺伝子の不適切な発現が有害であるとして、発達中に細胞同一性を維持するために重要である5,6.したがって、中国が哺乳類における抑圧的なクロマチンドメインの形成を促進するメカニズムを解明することは、細胞同一性を理解する上で根本的に重要である。
PRC2媒介クロマチンドメインを含むクロマチンドメイン形成を調査するように設計された過去の実験システムのすべては、クロマチンドメイン形成の展開イベントを追跡することができない定常状態条件下で行われた。細胞。ここでは、クロマチンドメインの初期募集と伝播を監視する誘導性細胞系を生成するための詳細なプロトコルを提示する。具体的には、H3K27me2/3を含むPRC2媒介性抑圧クロマチンドメインの形成を追跡することに焦点を当てる。クロマチンドメイン形成の機械的詳細を捕捉できるこのシステムは、H2AK119ubまたはH3K9meのいずれかを含む広く研究されたドメインのような他のクロマチンドメインを組み込むことに適合させることができる。ゲノミクスやイメージング技術と組み合わせることで、クロマチン生物学における様々な重要な問題にうまく対処する可能性があります。
Protocol
誘導性EEDレスキューMESCの生成 1. 細胞培養 4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)13の投与時に核に転移することができる安定に統合されたCreERT2トランスジーンを有するフィーダーフリーC57BL/6マウス胚性幹細胞(MESC)を使用する。 従来のESC培地14,15でMESCを成長させ、1000 U/mL LIF、1μM ERK阻害剤PD0325901および3μM GSK3阻害剤CHIR99021を補充し…
Representative Results
条件付き救助システムの一般的なスキーム図1は、内因性EED遺伝子座から発現されるWTまたはケージ変異体(Y365A)EEDを用いたEED KO細胞を条件付きで救出するターゲティングスキームを示す。その安定性と酵素活性に不可欠なPRC2のコアサブユニットであるEEDをノックアウトした後、EEDのエキソン9に続くイントロン内のカセットが導入される(図…
Discussion
特定のクロマチンドメインの形成中に機械的な詳細を理解するための強力なアプローチは、最初にドメインを破壊し、細胞内で進行中のその再構成を追跡することです。プロセスは、再構築中にいつでも一時停止して、進行中のイベントを詳細に分析できます。クロマチンドメインに関する以前の研究では、このような事象を解決することはできず、安定した状態下で行われました(例えば、…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿の改訂に感謝します。D.R.ラボは、ハワードヒューズ医学研究所と国立衛生研究所(R01CA199652およびR01NS100897)によってサポートされています。
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
参考文献
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