抗体喂养方法研究分离原发性希马培养物中的谷氨酸受体贩运

细胞利用贩运的活性过程来将蛋白质动员到特定的亚细胞定位中,并对其功能进行严格的时空调节1。这个过程对于跨膜受体尤其重要,因为细胞对不同环境刺激的反应依赖于受体激活触发的细胞内级联。细胞可以通过改变受体亚细胞贩运^调节2在细胞表面表达的受体的密度、定位和亚单位组成来改变这些反应。将新合成的受体插入血浆膜,以及内分泌和现有受体的循环利用,是确定表面表达受体2的净池的贩运过程^的例子。许多分子机制合作调节蛋白质贩运,包括蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰,如磷酸化、泛化或棕榈化2。

在结构高度专业化的强极化细胞中,特别需要调节受体贩运。典型的例子是通过调节贩运谷氨酸受体(GluRs)^控制神经元功能3,4。谷氨酸,主要兴奋神经递质,结合和激活表面表达的GluRs,以控制基本的生理神经元功能,如突触神经传递和突触可塑性。从神经发育障碍到神经退行性疾病,在广泛的神经病变中观察到了改变的GluR贩运,这一事实凸显了这个过程的重要性5。因此,了解控制GluR贩运的分子事件在许多研究领域是值得关注的。

在此协议中,使用基于抗体馈送的方法量化原海马神经元表面表达的GluRs水平,并评估内化和再循环的变化如何导致观察到的净表面表达。使用药理学和/或过度表达具有特定突变的外源受体,使该协议成为研究神经元适应不同环境刺激的分子机制的一种特别有力的方法。该协议效用的最后一个例子是研究环境中的多因素变化(如疾病模型中)通过检查此类模型中的表面表达如何影响 GluR 贩运。

使用具体的例子,初步演示了模仿生理突触刺激的药理学操作[化学LTP(cLTP)]如何增加AMPA型GluRs(AMPARs)^{内源性GluA1亚单位的表面表达6.}还分析了NMDA型GluRs(NmDARs)的GluN2B亚单位的过度表达磷-模拟形式的贩运,以说明如何利用该协议研究特定翻译后对GluR贩运的管制修改。虽然使用这些具体的例子,该协议可以很容易地应用于其他GluRs和其他受体和蛋白质,具有抗原细胞外域。如果没有可用于细胞外域的抗体,过度表达细胞外表位标记(例如,标记、Myc-、GFP 标记等)蛋白质有助于蛋白质标记。

当前协议提供了使用特定抗体量化特定 GluR 亚型密度和贩运的说明。该协议可用于研究 1) 总 GluR 表面表达,2) GluR 内化,以及 3) GluR 回收。要单独研究每个过程,建议从第 1 节和第 2 节开始,然后继续第 3、4 或 5 节。在所有情况下,以第 6 和 8 节结束 (图 1)。