해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근

세포는 특정 세포 국소화에 단백질을 동원하고 그들의 기능에 엄격한 spatiotemporal 규정을발휘하기 위하여 인신 매매의 적극적인 프로세스를 이용합니다 1. 이 과정은 다른 환경 자극에 세포 응답 수용 체 활성화에 의해 트리거 된 세포 내 캐스케이드에 의존 으로, 막 전 수용 체에 대 한 특히 중요 하다. 세포는 수용체 세포 인신 매매 조절을 통해 세포 표면에서 발현되는 수용체의 밀도, 국소화 및소단위 조성을 변경함으로써 이러한 반응을 수정할 수 있다 2. 플라즈마 막에 새로 합성 된 수용체의 삽입, 내분비증 및 기존 수용체의 재활용은 표면 발현 수용체의 순 풀을 결정하는 인신 매매 과정의 예2. 많은 분자 기계장치는 단백질 인산화, 유비퀴틴화, 또는 palmitoylation 2와 같은 단백질 단백질 상호 작용 및번역 후 수정을 포함하여 단백질 인신 매매를 통제하기 위하여 협력합니다.

수용체 인신 매매의 조절은 고도로 전문화된 구조물을 가진 강하게 편광된 세포에서 특히 요구됩니다. 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 규제된 인신매매에 의한 뉴런 기능의 조절이다^3,4. 조미료, 주요 흥분 성의 신경 전달 물질, 바인딩 및 시 냅 스 신경 전달 및 시 냅 스 가소성 등 기본적인 생리 신경 기능을 제어 하는 표면 표현 된 GluRs를 활성화. 변경된 GluR 인신 매매가 신경 발달 장애에서 신경 퇴행성 질환에 이르기까지 광범위한 신경 병증에서 관찰되었다는 사실은이 과정의 중요성을^강조5. 따라서, GluR 인신 매매를 제어하는 분자 사건을 이해하는 것은 연구의 많은 분야에서 관심입니다.

이 프로토콜에서, 항체 공급 기반 방법은 1 차적인 해마 뉴런에서 표면 발현 글루스의 수준을 정량화하고 관찰된 순 표면 발현에서 내재화 및 재활용의 변화가 어떻게 초래되는지 평가하기 위해 사용된다. 특정 돌연변이를 품고 있는 외인성 수용체의 약리학 및/또는 과발현의 사용은 이 프로토콜이 다른 환경 자극에 근본적인 신경 적응을 기초로 하는 분자 기계장치를 공부하기 위한 특히 강력한 접근을 만듭니다. 이 프로토콜의 유용성의 마지막 예는 환경의 다단계 변화(예: 질병 모델)가 이러한 모델의 표면 발현 검사를 통해 GluR 인신 매매에 미치는 영향을 연구하는 것입니다.

특정 한 예를 사용 하 여, 그것은 처음에 생리 적 시 냅 스 자극을 모방 하는 약리학 조작 을 입증 [화학 LTP (cLTP)] 내 인 성 GluA1 소부의 표면 발현을 증가 하는 글러스 (AMPARs)의 ⁶. NMDA 형 글루어 (NMDARs)의 GluN2B 하위 단위의 과발광 인광 모방 형태의 인신 매매는 또한이 프로토콜이 특정 번역 후 인신 매매의 규제를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 예시하기 위해 분석됩니다. 수정. 이러한 특정 예가 사용되지만, 이 프로토콜은 항원 세포 외 도메인을 소유한 다른 GluRs 및 기타 수용체 및 단백질에 쉽게 적용될 수 있다. 세포외 도메인에 사용할 수 있는 항체가 없는 경우, 세포외 에피토프 태그(예를 들어, 플래그-, Myc-, GFP 태그 등)의 과발현단백질은 단백질 라벨링을 지원할 수 있다.

현재 프로토콜은 특정 GluR 아류형 밀도를 정량화하고 특정 항체를 사용하여 트래피킹을 위한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 1) 총 GluR 표면 발현, 2) GluR 내재화 및 3) GluR 재활용을 연구하는 데 이용될 수 있다. 각 과정을 개별적으로 연구하려면 섹션 1과 2로 시작하여 섹션 3, 4 또는 5를 계속하는 것이 좋습니다. 모든 경우에 6과 8절(그림1)으로 마칩니다.