解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

細胞は、特定の細胞内局在度にタンパク質を動員し、その機能1に対して厳格な時空間調節を行うために、人身売買のアクティブなプロセスを利用する。異なる環境刺激に対する細胞応答は、受容体活性化によって引き起こされる細胞内カスケードに依存するように、このプロセスは、膜受容体にとって特に重要です。細胞は、受容体細胞内取引調節^規則2を介して細胞表面で発現される受容体の密度、局在化、およびサブユニット組成を変化させることによって、これらの応答を修飾することができる。新たに合成された受容体を血漿膜に挿入し、既存の受容体のエンドサイトーシスおよびリサイクルと共に、表面発現^受容体2のネットプールを決定する人身売買プロセスの例である。多くの分子機構は、タンパク質とタンパク質の相互作用やリン酸化、ユビキキテーション、またはパルミトイル化2などの翻訳後修飾を含むタンパク質の密売を調節するために協力する。

受容体の人身売買の調節は、高度に特殊化された構造を有する強い偏分細胞において特に必要とされる。パラダイムの例は、グルタミン酸受容体(GluR)3、4の規制された人身売買による神経機能の制御である。グルタミン酸は、主な興奮性神経伝達物質であり、シナプス神経伝達およびシナプス可塑性などの基本的な生理的神経機能を制御するために表面発現GluRを結合し、活性化する。変化したGluR人身売買が神経発達障害から神経変性疾患に至るまで、神経障害の広いスペクトルで観察されているという事実は、この^{プロセス5}の重要性を強調している。したがって、GluRの人身売買を制御する分子事象を理解することは、研究の多くの分野で興味深い。

このプロトコルでは、抗体供給ベースの方法を使用して、一次海馬ニューロンにおける表面発現GLURのレベルを定量化し、内部化およびリサイクルの変化が観察された正味表面発現にどのように生じるかを評価する。特定の変異を持つ外因性受容体の薬理学および/または過剰発現の使用は、このプロトコルが異なる環境刺激に対するニューロン適応の基礎となる分子メカニズムを研究するための特に強力なアプローチになります。このプロトコルの有用性の最終的な例は、このようなモデルにおける表面発現の検査を通じて、環境の多因子変化(疾患モデルなど)がGluRの人身売買にどのように影響するかを調べている。

具体的な例を用いて、生理シナプス刺激を模倣する薬理学的操作[化学LTP(cLTP)]がAMPA型GluR(AMPA)^{の内因性GluA1サブユニットの表面発現を増加させる方法を最初に実証する。6.}NMDA型GluR(NMA)のGluN2Bサブユニットの過剰発現リン模倣形態の人身売買も分析され、このプロトコルが特定の翻訳後のGluR人身売買の規制を研究するためにどのように使用できるかを示す。変更。これらの特定の例が使用されるが、このプロトコルは、抗原細胞外ドメインを有する他のGluRおよび他の受容体およびタンパク質に容易に適用することができる。細胞外ドメインに利用可能な抗体がない場合、細胞外エピトープタグ付き(例えば、フラグ、Myc-、GFPタグなど)タンパク質の過剰発現は、タンパク質標識を助けることができる。

現在のプロトコルは、特定のGluRサブタイプ密度を定量し、特定の抗体を使用して人身売買を行うための指示を提供する。このプロトコルは、1)総GluR表面発現、2)GluR内部化、および3)GluRリサイクルを研究するために利用することができる。各プロセスを個別に学習するには、セクション 1 と 2 から始め、セクション 3、4、または 5 のいずれかに進むことをお勧めします。いずれの場合も、セクション 6 と 8 (図1) で終了します。