Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Zellen nutzen den aktiven Prozess des Menschenhandels, um Proteine zu bestimmten subzellulären Lokalisationen zu mobilisieren und eine strenge raumzeitliche Regulierung über ihre Funktion auszuüben¹. Dieser Prozess ist besonders wichtig für Transmembran-Rezeptoren, da zelluläre Reaktionen auf verschiedene Umweltreize auf intrazellulären Kaskaden beruhen, die durch Dieoraktivierung ausgelöst werden. Zellen sind in der Lage, diese Reaktionen zu ändern, indem sie die Dichte, Lokalisierung und Zusammensetzung der Untereinheiten von Rezeptoren ändern, die an der Zelloberfläche über die subzelluläre Handelsverordnung^desRezeptors 2 ausgedrückt werden. Das Einsetzen von neu synthetisierten Rezeptoren in die Plasmamembran, zusammen mit Endozytose und Recycling bestehender Rezeptoren sind Beispiele für Menschenhandelsprozesse, die den Netzpool von oberflächenausgedrückten Rezeptoren bestimmen². Viele molekulare Mechanismen arbeiten zusammen, um den Proteinhandel zu regulieren, einschließlich Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitination oder Palmitoylierung².

Die Regulierung des Rezeptorhandels ist insbesondere in stark polarisierten Zellen mit hochspezialisierten Strukturen erforderlich. Das paradigmatische Beispiel ist die Kontrolle der neuronalen Funktion durch regulierten Handel mit Glutamatrezeptoren (GluRs)^3,4. Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter, bindet und aktiviert oberflächenexprimierte GluRs, um grundlegende physiologische neuronale Funktionen wie synaptische Neurotransmission und synaptische Plastizität zu steuern. Die Tatsache, dass veränderter GluR-Handel in einem breiten Spektrum von Neuropathien beobachtet wurde, von neuroentwicklungsbedingten Störungen bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen, unterstreicht die Bedeutung dieses Prozesses⁵. Daher ist das Verständnis der molekularen Ereignisse, die den GluR-Handel kontrollieren, in vielen Forschungsbereichen von Interesse.

In diesem Protokoll wird eine Antikörper-Fütterungsmethode verwendet, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten GluRs in primären Hippocampus-Neuronen zu quantifizieren und zu bewerten, wie Veränderungen der Internalisierung und des Recyclings zur beobachteten Nettooberflächenexpression führen. Die Verwendung von Pharmakologie und/oder Überexpression von exogenen Rezeptoren mit spezifischen Mutationen macht dieses Protokoll zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz für die Untersuchung molekularer Mechanismen, die der neuronalen Anpassung an verschiedene Umweltreize zugrunde liegen. Ein letztes Beispiel für den Nutzen dieses Protokolls ist die Untersuchung, wie sich multifaktorielle Veränderungen in der Umwelt (z. B. bei Krankheitsmodellen) durch die Untersuchung der Oberflächenexpression in solchen Modellen auf den GluR-Handel auswirkt.

Anhand spezifischer Beispiele wird zunächst demonstriert, wie eine pharmakologische Manipulation, die physiologische synaptische Stimulation imitiert [chemische LTP (cLTP)] die Oberflächenexpression der endogenen GluA1-Untereinheit des AMPA-Typs von GluRs (AMPARs) ^{erhöht. 6}. Der Handel mit einer überexprimierten phospho-mimetischen Form der GluN2B-Untereinheit von GluRs (NMDARs) vom Typ NMDA wird ebenfalls analysiert, um zu veranschaulichen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Regulierung des GluR-Handels durch spezifische posttranslationale Änderungen. Obwohl diese spezifischen Beispiele verwendet werden, kann dieses Protokoll leicht auf andere GluRs und andere Rezeptoren und Proteine angewendet werden, die antigene extrazelluläre Domänen besitzen. Für den Fall, dass keine Antikörper für extrazelluläre Domänen verfügbar sind, können Überexpression von extrazellulären Epitop-Tags (z. B. Flag-, Myc-, GFP-taggt, etc.) Proteine bei der Proteinkennzeichnung helfen.

Das aktuelle Protokoll enthält Anweisungen zur Quantifizierung der spezifischen GluR-Subtypdichte und des Menschenhandels mit spezifischen Antikörpern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 1) die gesamte GluR-Oberflächenexpression, 2) GluR-Internalisierung und 3) GluR-Recycling zu untersuchen. Um jeden Prozess einzeln zu studieren, wird empfohlen, mit den Abschnitten 1 und 2 zu beginnen und entweder mit Abschnitt 3, 4 oder 5 fortzufahren. In allen Fällen mit den Abschnitten 6 und 8 beenden (Abbildung 1).