نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة
概要
تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.
Abstract
الاستجابات الخلوية للمحفزات الخارجية تعتمد بشكل كبير على مجموعة من المستقبلات التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية في لحظة معينة. وبناء على ذلك، فإن عدد المستقبلات التي يعبر عنها السطح يتكيف باستمرار ويخضع لآليات صارمة للتنظيم. المثال النموذجي واحد من أحداث الاتجار الأكثر دراسة في علم الأحياء هو السيطرة المنظمة للتعبير متشابك من مستقبلات الغلوتامات (غلورس). تتوسط GluRs الغالبية العظمى من انتقال الأعصاب المحفزة في الجهاز العصبي المركزي والسيطرة على التغيرات الوظيفية والهيكلية التي تعتمد على النشاط الفسيولوجي على مستويات متشابك والخلايا العصبية (على سبيل المثال، اللدونة متشابك). التعديلات في عدد, موقع, وتكوين الوحدة الفرعية من السطح أعرب GluRs تؤثر بعمق على وظيفة الخلايا العصبية، وفي الواقع, ترتبط التعديلات في هذه العوامل مع اعتلال اتّصالات عصبيّة مختلفة. المعروضة هنا هي طريقة لدراسة الاتجار GluR في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر المنفصلة. يتم استخدام نهج “تغذية الأجسام المضادة” لتصور بشكل تفاضلي مجموعات غلور المعبر عنها في السطح والأغشية الداخلية. من خلال وضع علامات على مستقبلات السطح على الخلايا الحية وإصلاحها في أوقات مختلفة للسماح لمستقبلات بطانة الرحم و / أو إعادة التدوير، يمكن تقييم عمليات الاتجار هذه ودراستها بشكل انتقائي. هذا هو بروتوكول تنوعا التي يمكن استخدامها في تركيبة مع النهج الدوائية أو الإفراط في التعبير عن المستقبلات المعدلة للحصول على معلومات قيمة حول المحفزات والآليات الجزيئية التي تؤثر على الاتجار GluR. وبالمثل, ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة مستقبلات أخرى أو البروتينات السطحية أعرب.
Introduction
الخلايا الاستفادة من العملية النشطة للاتجار لتعبئة البروتينات لتوطين تحت الخلية محددة وممارسة صارمة spatiotemporal التنظيم على وظيفتها1. هذه العملية مهمة بشكل خاص لمستقبلات عبر الغشاء، كما الاستجابات الخلوية لمختلف المحفزات البيئية تعتمد على السلاسل التعاقبية داخل الخلايا الناجمة عن تنشيط مستقبلات. الخلايا قادرة على تعديل هذه الاستجابات عن طريق تغيير الكثافة، والتوطين، وتكوين الوحدة الفرعية من المستقبلات المعبر عنها على سطح الخلية عن طريق مستقبلات تحت الخلية تنظيم الاتجار2. إدراج مستقبلات مُدمجة حديثاً في غشاء البلازما، جنباً إلى جنب مع بطانة الرحم وإعادة تدوير المستقبلات الموجودة هي أمثلة على عمليات الاتجار التي تحدد المجموعة الصافية من المستقبلات التي يعبر عنها السطح2. العديد من الآليات الجزيئية تتعاون لتنظيم الاتجار بالبروتين، بما في ذلك تفاعلات البروتين البروتين والتعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفورية، أو التعليب، أو palmitoylation2.
إن تنظيم الاتجار بالمستقبلات مطلوب بشكل خاص في الخلايا المستقطبة بشدة ذات الهياكل المتخصصة للغاية. المثال النموذجي هو السيطرة على وظيفة الخلايا العصبية عن طريق تنظيم الاتجار بمستقبلات الغلوتامات (GluRs)3،4. الجلوتامات، الناقل العصبي المحفز الرئيسي، يربط وينشط الغلورس التي يعبر عنها السطح للسيطرة على الوظائف العصبية الفسيولوجية الأساسية مثل انتقال الأعصاب متشابك واللدونة متشابك. حقيقة أن تغيير الاتجار GluR لوحظ في مجموعة واسعة من الاعتلالات العصبية، بدءا من اضطرابات النمو العصبي إلى الأمراض العصبية التنكسية، يسلط الضوء على أهمية هذه العملية5. وبالتالي، فإن فهم الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الاتجار بجلوآر هو أمر ذو أهمية في العديد من مجالات البحث.
في هذا البروتوكول، يتم استخدام طريقة تعتمد على تغذية الأجسام المضادة لتحديد مستوى الغلورس التي يتم التعبير عنها على السطح في الخلايا العصبية الرئيسية لفرس النهر، فضلاً عن تقييم كيفية تؤدي التغيرات في الاستيعاب وإعادة التدوير إلى التعبير الصافي للسطح الملاحظ. استخدام الصيدلة و / أو التعبير المفرط من المستقبلات الخارجية التي تأوي طفرات محددة يجعل هذا البروتوكول نهجا قويا بشكل خاص لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء التكيف الخلايا العصبية لمختلف المحفزات البيئية. ومن الأمثلة النهائية على فائدة هذا البروتوكول دراسة كيفية تأثير التغيرات المتعددة العوامل في البيئة (كما هو الحال في نماذج المرض) على الاتجار بجلوآر من خلال فحص التعبير السطحي في هذه النماذج.
باستخدام أمثلة محددة، يتم إثبات في البداية كيف أن التلاعب الدوائي الذي يحاكي التحفيز الفسيولوجي متشابك [LTP الكيميائية (cLTP)] يزيد من التعبير السطحي للوحدة الفرعية GluA1 الذاتية من نوع AMPA من GluRs (AMPARs) 6– ويجري أيضا تحليل الاتجار بشكل فوسفي – mimetic مبالغ فيه من الوحدة الفرعية GluN2B من نوع الغلورس NMDA (NMDARs) لتجسيد كيفية استخدام هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الاتجار بجلوران اتّصالا ً بمرحلة ما بعد الترجمة التعديلات. على الرغم من أن هذه الأمثلة المحددة تستخدم، يمكن بسهولة تطبيق هذا البروتوكول على GluRs الأخرى وغيرها من المستقبلات والبروتينات التي تمتلك مجالات خارج الخلية المضادة للجينات. في حالة عدم وجود أجسام مضادة متاحة للمجالات خارج الخلية، يمكن أن تساعد البروتينات في وضع العلامات على البروتين في وضع العلامات على الأيض خارج الخلية (على سبيل المثال، العلم، Myc-، GFP-agged، إلخ).
ويوفر البروتوكول الحالي تعليمات لتحديد الكثافة الفرعية المحددة للغلور والاتجار بها باستخدام أجسام مضادة محددة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة 1) مجموع التعبير السطحي GluR، 2) استيعاب GluR، و 3) إعادة تدوير GluR. ولدراسة كل عملية على حدة، يُنصح بالبدء بالقسمين 1 و2 ومواصلة العمل إما في القسم 3 أو 4 أو 5. في جميع الحالات، الانتهاء معالقسمين 6 و 8 (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
التفاعل بين الخلية وبيئتها (على سبيل المثال، التواصل مع الخلايا الأخرى، والاستجابة لمحفزات مختلفة، وما إلى ذلك)، يعتمد بشكل كبير على التعبير الصحيح للمستقبلات على سطح الخلية. التنظيم السريع والدقيق في محتوى المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح يتيح الاستجابة الخلوية المناسبة لبيئ…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز نورث ويسترن للتنظير المجهري المتقدم على استخدام مجهر نيكون A1 البؤري ومساعدتهم في تخطيط وتحليل التجارب. وقد تم دعم هذا البحث من قبل NIGMS (T32GM008061) (A. M.), وNIA (R00AG041225) ومنحة الباحث الشباب NARSAD من مؤسسة بحوث الدماغ والسلوك (#24133) (A. S. -C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
参考文献
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
