바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

모든 인간 적인 sera 처리 하 고 보호 개인 장비의 사용 으로 생물 안전에 대 한 승인 된 기관 프로토콜에 따라 폐기. 이 프로토콜에 참여하는 모든 실험실 직원은 생물 안전 및 연구 윤리 에 대한 교육을 받았습니다. 1. 인플루엔자 항원 마이크로어레이 생성 마이크로어레이용 항원 세트 설계 및 획득 용이성 분말로 발현 및 정제 된 단백질 항원을 얻었다. 마이크로어레이 슬라이드에 항원 인쇄 인산완충식염수(PBS)에서 각각의 동포화된 항원을 0.001% 트웬-20(T-PBS)으로 0.1 mg/mL의 농도로 재구성한다. 각 재구성 된 항원의 10 μL을 처리되지 않은 384 웰 플랫 바닥 플레이트의 개별 우물로 옮김. 마이크로어레이 프린터를 사용하여 항원을 인쇄(이 연구에 사용된 마이크로어레이 프린터는 더 이상 상용화되지 않음, 토론참조) 항원을 시료 채널에 흡인하고 직접 통해 침전하는 저용량 마이크로어레이 스포팅 핀으로 16 패드 니트로 셀룰로오스 코팅 유리 슬라이드에 접촉 및 모세관 작용. 소스 플레이트 구성 및 인쇄 매개변수로 인쇄 소프트웨어(예: 그리드더)를 프로그래밍합니다. 풀다운 메뉴를 사용하여 이 인쇄 방법과 함께 사용할 플레이트 유형의 이름을 선택합니다. 이 연구를 위해, 처리되지 않은 384 웰 플랫 바닥 플레이트를 사용하십시오. 플레이트 번호 옆에 있는 텍스트 상자를 선택하고 이 인쇄 프로토콜에 사용할 샘플 플레이트 수를 입력합니다. 이 연구를 위해 1 접시를 사용하십시오. 이 방법으로 사용할 핀 구성을 선택합니다. 이 스터디에서는 8핀 구성을 사용합니다. 원점이 슬라이드 원소(관리 섹션에서 보정)와 인쇄 핀이 슬라이드에서 인쇄를 시작하는 위치 사이의 거리(X- 및 Y-방향)인지 확인합니다. 배열 디자인 탭을 사용하여 배열의 크기와 모양(도트 간격 및 하위 배열당 점 수)을 정의합니다. 이 연구를 위해 8핀을 사용하여 18×18 형식으로 16패드 슬라이드에 324개 스팟(직경 180μm 간격으로 300μm 간격)을 인쇄합니다. 인쇄 핀이 샘플을 선택하고 분배하는 방법에 대한 매개 변수를 선택합니다. 이 연구를 위해 각 핀은 항원 용액 250 nL을 흡인하고 40 개의 반점 각각에 1 nL을 인쇄합니다 (8 핀 전체에 대해 총 20 개의 슬라이드). 핀 청소 프로토콜 및 블로팅 프로토콜을 구성합니다. 이 연구를 위해, 각 핀은 항원을 인쇄하고, 소각 세척 용기에 멸균 ddH2O에 담근 다음 다음 항원을 흡인한다. 샘플 블록이 슬라이드에 인쇄되는 순서를 정의합니다. 어레이 소프트웨어는 각 마이크로어레이 내에서 항원의 배열을 설명하기 위해 추가된 그리드 인덱스(.gal) 파일을 구성합니다.참고: 상단 행은 이미징 중에 그리드를 방향을 지정하기 위해 (예 : Qdot 585 nm 스트렙타비딘 컨쥬게이트 와 Qdot 800 nm 스트렙타비딘 컨쥬게이트의 혼합과 같은 이미징에 사용되는 모든 파장에서 형광과 함께) fiducials에 사용됩니다. 긴 인쇄 실행의 경우, 소스 플레이트의 항원은 주기적으로 위아래로 파이펫팅한 다음 원심 분리를 통해 다시 부유할 수 있으며, 새로운 소스 플레이트를 준비하고 사용할 수 있습니다. 프로브되지 않은 마이크로어레이 슬라이드를 내광 상자에 놓고 실온의 건조기 캐비닛에 보관하여 장기간 보관하십시오.참고: 이 시점에서 프로토콜이 무기한 일시 중지될 수 있습니다. 품질 관리 검사 수행(폴리 히스티딘 태그 필요) 슬라이드를 프로빙 챔버에 부착하고 단계 2.1.1-2.1.2에 설명된 바와 같이 차단 버퍼로 수분을 재수화하고 도2에 도시된 바와 같이. 마우스 단클론 폴리-그의 항체를 1:100 여과된 1x 차단 버퍼로 희석시켰다.참고: 비정제 단백질 항원(예: 시험관 내 전사 및 번역 시스템으로 발현)이 마이크로어레이를 인쇄하는 데 직접 사용되는 경우, 단백질 발현 시스템의 성분(예를 들어, 대장균 용해물)을 1:10의 비율로 추가합니다. 이러한 구성 요소에 대한 지시 된 항체를 차단하기 위해 혈청 희석에 사용되는 차단 버퍼. 100 μL의 희석 된 폴리 – 그의 항체를 포인포인 후 어레이 패드를 포함하는 각 슬라이드 챔버에 넣고 실온에서 2 시간 동안 배양하거나 셰이커에서 4 °C에서 밤새 배양하십시오. 2.2.1단계에서 설명한 대로 T-TBS 버퍼로 3x 세척합니다. 비오틴-접합 염소 항마우스 IgG 보조 항체를 차단 완충액에서 1:200으로 희석하고, 포부 후 잘 당 100 μL을 추가하고, 셰이커상에서 실온에서 1시간 동안 배양한다. T-TBS 버퍼로 3x를 씻으소서. Qdot 585 nm 스트렙타비딘 컨쥬게이트를 블로킹 버퍼에서 4 nM으로 희석하고, 포인포인 후 잘 당 100 μL을 추가하고, 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. T-TBS 버퍼로 3x를 씻은 다음 TBS 버퍼로 한 번 씻으소서(트웬 없이). 단계 2.2.5 – 3.1.2에 설명된 대로 슬라이드를 분리하고 정량화합니다.참고: 단백질 항원이 품질 관리 프로토콜을 사용하려면 그의10개의 태그를 포함해야 합니다. 대안적으로, 상이한 태그가 포함되는 경우, 품질 관리 검사는 그 태그에 대한 항체 또는 리간드로 수행될 수 있다. 2. 마이크로어레이를 이용한 인플루엔자 항체용 프로브 세라 항체 결합을 위한 마이크로어레이에 인큐베이트 세라 그림3과 같이 클립을 사용하여 챔버에 마이크로어레이 슬라이드를 연결하고 프레임에 배치합니다.참고: 항상 핸즈어계열이 있는 마이크로어레이 패드를 건드리지 마십시오. 슬라이드가 패드 측면위쪽으로 방향을 정하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 작은 노치가 있는지 확인합니다. 여과된 1x 차단 버퍼의 웰당 100 μL의 마이크로어레이 슬라이드를 재수화하고, 차단 버퍼의 100 μL에서 혈청 1:100을 희석합니다(처리되지 않은 96웰 플레이트 또는 2 mL 튜브를 사용할 수 있음). 100-250 rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 30 분 동안 덮인 프레임과 희석 된 세라에 재수화 된 마이크로 어레이 슬라이드를 배양하십시오. 셰이커에서 모든 후속 인큐베이션 단계를 유사하게 수행합니다.참고: 혈라는 동결 해동 주기를 최소화하기 위해 장기 보관을 위해 -80 °C에서 aliquoted 및 냉동되어야하며 사용하기 전에 미립자를 제거하기 위해 혼합및 원심 분리를 혼합하여 원심 분리해야합니다. 슬라이드 챔버를 재조립해야 하는 누출을 감지하기 위해 이 단계 중과 이후에 슬라이드 챔버를 주의 깊게 관찰하십시오. 보조 수집 플라스크와 진공 라인에 연결된 파이펫 팁을 사용하여 패드를 건드리지 않고 각 챔버의 모서리에서 조심스럽게 차단 버퍼를 흡인합니다. 이후의 모든 흡인 단계를 유사하게 수행합니다. 패드가 건조하지 않도록 포부 후 신속하게 패드에 희석 된 세라를 추가합니다. 축축한 종이 타월로 둘러싸인 보조 용기 안에 트레이에 덮인 프레임을 놓고 증발을 방지하기 위해 밀봉하십시오. 흔들 쉐이커에 4 °C에서 밤새 배양 (또는, 100-250 rpm에서 궤도 셰이커에 실온에서 2 시간 동안 배양 할 수 있습니다). 양자점 컨쥬게이트 이차 항체를 가진 표지 결합 혈청 항체 위에서 설명한 바와 같이 챔버에서 흡인 세라를 신중하게, T-TBS 버퍼의 웰 당 100 μL을 추가 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 에서 ddH2O pH 7.5로 조정하고 여과, 궤도 셰이커에서 5 분 동안 배양) 100-250 rpm. 이 세척 단계를 총 3x 반복합니다 (모든 후속 세척 단계가 유사하게 수행됩니다). 블로킹 버퍼에서 1 μM으로 희석된 이차 항체의 혼합물을 준비하고 사용 전과 사용 중에 균질성을 유지하기 위해 파이펫팅하여 철저히 혼합합니다.참고: 분석 재현성을 유지하기 위해, 각 이차 항체의 동일한 배치는 실험 전반에 걸쳐 데이터의 정량적 비교가 계획된 모든 프로빙 실험에 사용되어야 합니다. 이차 항체의 특정 농도는 친화성에 따라 달라질 필요가 있다; 가능한 경우 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 최종 세척 후 챔버에서 흡기 완충액을, 이차 항체 혼합물의 웰 당 100 μL을 추가하고, 셰이커에 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 흡인 이차 항체 혼합물은 T-TBS 완충액으로 3x 세척한 다음 TBS 버퍼로 한 번 세척합니다(트웬 없이). 패드를 만지지 않도록 챔버에서 마이크로어레이 슬라이드를 조심스럽게 분리하고, 여과된 ddH 2O로 부드럽게 헹구고, 50 mL 튜브에 넣고 500 x g에서 원심분리하여 10분 동안 건조시다. 프로브 된 마이크로 어레이 슬라이드를 내광 상자에 놓고 장기 보관을 위해 실온에서 건조기 캐비닛에 보관하십시오.참고: 이 시점에서 프로토콜은 최대 1주동안 일시 중지될 수 있습니다. 3. 마이크로어레이 내 항원과 결합하는 항체를 정량화 마이크로어레이 슬라이드를 시각화하고 스팟 형광 강도를 정량화하여 항체 결합을 측정합니다. 내장 소프트웨어가 내장된 휴대용 이미저를 사용하여 마이크로어레이 슬라이드 이미지를 수집합니다. 이미저 구성 탭에서 적절한 슬라이드 구성을 선택합니다. 이 연구에서는 16패드 슬라이드를 사용합니다. 이미지 제어 탭에서 적절한 형광 채널을 선택하고 세라의 반응성에 따라 게인, 노출 시간 및 수집 시간을 조정하여 최적의 이미지를 얻습니다. 본 연구를 위해, IgA 및 IgG를 위한 형광 채널은 각각 585 nm 및 800 nm이고, 화상 진찰 설정은 50의 이득, 500 ms의 노출 시간 및 1 s의 취득 시간 이었습니다. 캡처를 클릭하여 이미지 획득 프로세스를 시작합니다.참고: 마이크로어레이 슬라이드는 어둡고 건조한 상태에서 신호를 저하없이 여러 설정에서 다시 이미지화할 수 있습니다. 슬라이드와 호환되는 경우 다른 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다. fiducial 마커를 기반으로 그리드를 사용하여 배열 스팟을 감지하고 스팟 주위에서 측정된 픽셀 강도에서 배경에서 제외된 배경의 중앙값으로 스팟 강도를 측정합니다. 1.2.2단계에서 구성된 .gal 파일을 활용하여 각 마이크로어레이의 개별 항원과 스팟 강도를 연결하는 내장 된 이미저 소프트웨어를 사용하여 이 정량화 알고리즘을 일괄적으로 수행합니다. 파일 정보 패널에서 컴퓨터의 폴더에서 선택하여 .gal 파일을 업로드하고 분석 출력 파일이 분석 옵션 섹션에 저장할 폴더를 지정합니다. 이미지 제어 탭에서 획득한 이미지 중 하나를 열어 정량화하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 자동 단추를 선택합니다. 오른쪽 하단의 배열 분석 섹션에서 소프트웨어의 지시에 따라 신탁 템플릿을 만듭니다. 일괄 처리를클릭하고 정량화할 이미지가 포함된 폴더를 선택하고 이전 단계에서 만든 신탁 템플릿을 선택합니다. 이 소프트웨어는 각 이미지를 분석하고 스팟 강도를 정량화합니다.참고: 이 단계는 스프레드시트 조작 또는 분석 소프트웨어에서 이후에 조작될 수 있는 마이크로어레이상의 각 개별 항원에 결합하는 각 혈청 시편 내에서 항체를 정량화하는 스팟 강도를 포함하는 .csv 파일을 생성한다. 원시 데이터를 분석하여 항원 과 혈청 표본 전반에 걸쳐 항체 결합을 비교합니다. 본 연구를 위해, IgA 및 IgG 항체는 585 nm 및 800 nm 형광 점점 강도로 측정되었고, 다른 날에 다른 슬라이드를 사용하여 실험의 2개의 독립적인 실행 사이에서 모든 항원에서 비교되었고, 상관관계 분석은 수행되었다. 측정 분석 재현성.참고: 발현 혼합물로 인쇄된 정제되지 않은 단백질의 경우, 데이터 분석은 DNA 제어가 없는 배경 감산으로 시작해야 합니다.