インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

すべての人間のセラは、保護パーソナル機器を使用してバイオセーフティのための承認された制度プロトコルに従って処理され、処分されます。このプロトコルに参加するすべての研究室の職員は、バイオセーフティと研究倫理の訓練を受けています。 1. インフルエンザ抗原マイクロアレイの生成 マイクロアレイ用抗原セットの設計と取得 凍結乾燥粉末として発現および精製タンパク質抗原を得る。 マイクロアレイスライドに抗原を印刷する 各凍結乾燥抗原をリン酸緩衝生理食塩基中の0.1mg/mLの濃度に0.001%のTween-20(T-PBS)で再構成する。未処理の384ウェル平底板の個々のウェルに再構成された抗原の10μLを移す。 マイクロアレイプリンタを使用して抗原を印刷する(この研究で使用されるマイクロアレイプリンタはもはや市販されていない、議論を参照)、サンプルチャネルに抗原を吸引し、直接介して堆積する少量のマイクロアレイスポッティングピンを使用して、議論を参照してください。16パッドのニトロセルロースコーティングガラススライドに接触し、毛細血管アクション。 ソース・プレートの構成と印刷パラメータを使用して、印刷ソフトウェア(Gridderなど)をプログラムします。 プルダウン メニューを使用して、この印刷方法で使用するプレート タイプの名前を選択します。この研究では、未処理の384ウェルフラットボトムプレートを使用します。 [プレート数]の横にあるテキスト ボックスを選択し、この印刷プロトコルで使用するサンプル プレートの数を入力します。このスタディでは、1つのプレートを使用します。 この方法で使用するピン構成を選択します。このスタディでは、8 ピン構成を使用します。 原点オフセットが、スライドの原点 (管理セクションで校正されている) と、印刷ピンがスライド上で印刷を開始する位置との間の距離 (X 方向と Y 方向) であることを確認します。 [配列の設計] タブを使用して、配列のサイズと形状 (ドット間隔とサブ配列あたりのドット数) を定義します。このスタディでは、8ピンを使用して18×18形式の16パッドスライドに324個(直径180μm、間隔300μm)を印刷します。 印刷ピンがサンプルをピックアップして分配する方法のパラメータを選択します。この研究では、各ピンは抗原溶液の250 nLを引き出し、40箇所のそれぞれに1 nLを印刷します(全8ピンにつき合計20枚のスライド)。 ピンクリーニングプロトコルとブロッティングプロトコルを設定します。この研究では、各ピンが抗原を印刷し、超音波洗浄容器内の無菌ddH2Oに浸漬し、次の抗原をアセチマチ化する。 サンプル ブロックをスライドに印刷する順序を定義します。アレイソフトウェアは、各マイクロアレイ内の抗原の配置を記述するために、アレイグリッドインデックス(.gal)ファイルを構築します。注:一番上の行は、イメージングに使用されるすべての波長で蛍光を使用し、例えば、Qdot 585 nmストレプトアビジンコンジュゲートとQdot 800 nmストレプトアビジンコンジュゲートの混合物)をイメージング中にグリッドの向きに使用します。長時間の印刷実行では、ソースプレート内の抗原を、ピペッティングして上下にピペ状にして、遠心分離機を定期的に再懸濁させたり、新しいソースプレートを作成して使用したりできます。 プローブされていないマイクロアレイスライドを防光ボックスに入れ、室温でデシケータキャビネットに保管して長期保存します。注: この時点で、プロトコルは無期限に一時停止される場合があります。 品質管理チェックを実行する(ポリヒスチジンタグが必要) ステップ 2.1.1-2.1.2 で説明し、図 2に示すように、プローブ チャンバにスライドを取り付け、ブロッキング バッファで水分補給します。 濾過された1xブロッキングバッファーでマウスモノクローナルポリヒス抗体1:100を希釈する。注:非精製タンパク質抗原(例えば、インビトロ転写および翻訳系で発現される)がマイクロアレイの印刷に直接使用される場合、タンパク質発現系の成分(例えば、大腸菌リサート)を1:10の比率で追加し、これらの成分に対して向けられた任意の抗体を遮断するために血清希釈に使用されるブロッキングバッファー。 吸引後にアレイパッドを含む各スライドチャンバに希釈されたポリヒス抗体を100μL追加し、室温で2時間、またはシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。ステップ 2.2.1 で説明したように、T-TBS バッファーで 3x を洗浄します。ビオチン結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体1:200をブロッキングバッファーに希釈し、吸引後1ウェル当たり100μLを添加し、シェーカー上の室温で1時間インキュベートする。T-TBSバッファで3倍を洗浄します。 希釈Qdot 585 nm連鎖化ビンはブロッキングバッファーで4nMに結合し、吸引後にウェル当たり100μLを加え、シェーカーの室温で1時間インキュベートする。T-TBSバッファで3xを洗浄し、その後TBSバッファで1回(Tweenなし)。 手順 2.2.5 ~ 3.1.2 で説明されているように、スライドを分解して定量化します。注:タンパク質抗原は、この品質管理プロトコルを使用するために、His10タグを含む必要があります。あるいは、別のタグが含まれている場合、そのタグの抗体またはリガンドを使用して品質管理チェックを行うことができます。 2. マイクロアレイを用いたインフルエンザ抗体のプローブセラ 抗体結合のためのマイクロアレイ上のセラをインキュベートする クリップを使用してマイクロアレイスライドをチャンバーに取り付け、図3に示すようにフレーム内に配置します。注:常に手や楽器でマイクロアレイパッドに触れないようにしてください。スライドがパッド側を上に、右上隅の小さなノッチの向きであることを確認します。 濾過された1xブロッキングバッファーのウェルあたり100 μLのマイクロアレイスライドを再水和し、ブロッキングバッファーの100 μLで血清1:100を希釈します(未処理の96ウェルプレートまたは2 mLチューブを使用できます)。カバーされたフレームで水分補給されたマイクロアレイスライドと希釈されたセラの両方を、100-250 rpmの軌道シェーカーの室温で30分間別々にインキュベートします。シェーカーで同様に、後続のすべてのインキュベーション手順を実行します。注:Seraは、凍結融解サイクルを最小限に抑えるために-80 °Cでアリクォートおよび凍結する必要があり、使用前に微粒子を除去するために混合し、遠心分離する必要があります。スライドチャンバの組み立て直しが必要な漏れを検出するには、このステップの間および後にスライドチャンバを注意深く観察してください。 二次コレクションフラスコと真空ラインに接続されたピペットの先端を使用して、パッドに触れることなく、各チャンバーのコーナーから慎重にブロッキングバッファを吸引します。後続のすべての吸引手順を同様に実行します。パッドが乾燥しないように、吸引後すぐにパッドに希釈されたセラを追加します。 湿ったペーパータオルで囲まれた二次容器の中に覆われたフレームをトレイに入れ、蒸発を防ぐために密閉します。ロッキングシェーカーで一晩4°Cでインキュベートします(または、100-250 rpmでオービタルシェーカーの室温で2時間インキュベートすることができます)。 量子ドット共役二次抗体を使用した標識結合血清抗体 上記のように室から慎重に吸引セラを、T-TBSバッファーのウェル当たり100μLを加え(20mM Tris-HCl、150 mM NaCl、ddH2Oで0.05%Tween-20をpH 7.5に調整し、濾過し、商業的に得ることができ、軌道上で5分間インキュベートすることができる)100-250のrpm。この洗浄工程を合計3倍繰り返します(後続のすべての洗浄工程も同様に行われます)。 ブロッキングバッファーで1μMに希釈した二次抗体の混合物を調作し、均質性を維持するために使用前および使用中にピペッティングによって完全に混合する。注:アッセイの再現性を維持するために、各二次抗体の同じバッチを、実験間のデータの定量的比較が計画されているすべてのプローブ実験に使用する必要があります。二次抗体の特異的濃度は、親和性に応じて変化する必要があります。可能な限り製造元のプロトコルに従ってください。 最終洗浄後にチャンバーから吸引バッファーを吸引し、二次抗体混合物のウェル当たり100μLを加え、シェーカー上の室温で2時間インキュベートする。 二次抗体混合物をT-TBSバッファーで3倍洗浄し、その後TBSバッファーで1回洗浄する(Tweenなし)。 マイクロアレイは、パッドに触れないように注意深くチャンバーからスライドし、濾過されたddH2Oで穏やかに洗い流し、50 mLチューブに入れ、500 x gで10分間遠心を入れて乾燥させます。 プローブされたマイクロアレイスライドを防光ボックスに入れ、室温でデシケータキャビネットに保管して長期保存します。注: この時点で、プロトコルは最大 1 週間一時停止される場合があります。 3. マイクロアレイ内の抗原への抗体結合を定量化する マイクロアレイスライドを可視化し、スポット蛍光強度を定量して抗体結合を測定 内蔵ソフトウェアを使用してポータブルイメージャーを使用してマイクロアレイスライドの画像を取得します。 [イメージャーの構成] タブで、適切なスライド構成を選択します。この調査では、16 パッドのスライドを使用します。 [画像制御]タブで、適切な蛍光チャネルを選択し、セラの反応性に応じてゲイン、露光時間、取得時間を調整して最適な画像を得ます。本研究では、IgAとIgGの蛍光チャネルはそれぞれ585nmと800nmであり、撮像設定は50、露光時間は50ms、集録時間は1秒であった。 [キャプチャ]をクリックして、イメージの取得プロセスを開始します。注:マイクロアレイスライドは、暗くて乾燥して保存されている限り、信号の劣化なしに複数の設定で再イメージ化することができます。スライドと互換性がある場合は、他のイメージングシステムを使用できます。 フィデューシャルマーカーに基づいて配向されたグリッドを使用して配列スポットを検出し、スポット周辺で測定されたピクセル強度から背景を引いた背景の中央値としてスポット強度を測定します。この定量アルゴリズムは、ステップ 1.2.2 で構築された .gal ファイルを使用して、各マイクロアレイ上の個々の抗原にスポット強度を接続する組み込みのイメージャー ソフトウェアを使用してバッチで実行します。 [ファイル情報]パネルで、コンピュータ上のフォルダから選択して .gal ファイルをアップロードし、分析出力ファイルを[分析オプション]セクションに保存するフォルダを指定します。 [イメージコントロール] タブで、取得した画像の 1 つを開いて定量化し、右上隅にある[自動]ボタンを選択します。 右下隅の[アレイ分析]セクションで、ソフトウェアの指示に従って fiducial テンプレートを作成します。 バッチ分析をクリックし、定量化するイメージを含むフォルダを選択し、前の手順で作成した fiducial テンプレートを選択します。ソフトウェアは、各画像を分析し、スポット強度を定量化します。注:このステップでは、各血清試料内の抗体を定量するスポット強度を含む.csvファイルを生成し、その後、スプレッドシート操作または解析ソフトウェアで操作することができるマイクロアレイ上の個々の抗原に結合します。 生データを分析して、抗原間および血清標本間の抗体結合を比較します。本研究では、585nmと800nmの蛍光スポット強度として測定されたIgA抗体とIgG抗体を、異なる日に異なるスライドを用いた実験の2つの独立した実行間のすべての抗原間で比較し、相関分析を行った。アッセイの再現性を測定します。注:発現混合物として印刷される非精製タンパク質の場合、データ分析はDNAコントロールなしのバックグラウンド減算から始める必要があります。