Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Massenspektrometrie (MS) ist eine technologische Erkenntnis des Reduktionismus; es reduziert das Analyseobjekt auf eine Einheit, die auf der Grundlage molekularer Arten oder Kaskaden interpretiert werden kann. Daher ist es eine repräsentative Methode der analytischen Chemie. Es besteht aus vier Prozessen: Ionisierung, Analyse, Detektion und spektrale Erfassung. Da die Ionisierung des Moleküls der erste Prozess in der Massenspektrometrie ist, schränkt es in der Regel die Form der zu verarbeitenden Analyten ein. Die meisten Ionisationsverfahren erfordern die Zerstörung der Struktur, Morphologie und echtzeitbiologischen Prozesse von organischen Proben. Beispielsweise erfordert die Elektrospray-Ionisation (ESI) MS, dass sich die Proben für eine effiziente Ionisierung in einem flüssigen Zustand befinden¹. Proben müssen daher eine komplexe biochemische Zubereitung durchlaufen, die die Zusammensetzung von Molekülen verändert. Während die matrixgestützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI) MS molekulare Karten von dünnem Schnittgewebe^{rekonstruieren kann,}ist^dieIonisationseffizienz zu gering, um alle Moleküle in den Proben zu erkennen, und es ist besonders schlecht bei der Analyse von Fettsäuren. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen kann die Sondenelektrospray-Ionisation (PESI)⁴ verwendet werden, um die Echtzeit-Änderungen in biologischen Systemen in situ zu beobachten, ohne die strukturelle Integrität zu zerstören⁵, während sich der beobachtete biologische Organismus technisch in einem lebendigen Zustand befindet. In diesem Fall wird eine sehr feine Nadel verwendet, die gleichzeitig als Probenpflücker und Ionenemitter dient. Dies bedeutet, dass die komplexen Probenvorbehandlungssequenzen umgangen werden können, um Massenspektren zu erhalten, die die molekularen Komponenten des lebenden Systems in situ widerspiegeln.

Es gibt mehrere andere Ionisationsmethoden, die PESI-MS Konkurrenz machen. Eine davon ist die schnelle Verdunstungsionisationsmassenspektrometrie (REIMS)⁶. Diese Technik funktioniert gut während der Operation, weil sie mit einem elektrischen Messer montiert wird und die Ionenfahne sammelt, die während des Schnittes erzeugt wird. Während REIMS sehr nützlich für die Operation ist, ist es im Wesentlichen eine destruktive Methode, die die elektrische Ablation des Gewebes erfordert. Daher ist es nicht nützlich für die detaillierte Analyse von Zellen und Geweben in einer präparativen Probe oder in Laboranalysen. Darüber hinaus, weil es eine große Menge an Pflaumen sammelt, die Gewebeablagerungen enthalten, erfordert es eine lange Wartung der Geräte nach jedem Gebrauch, wodurch die Verwendung dieser Maschine auf spezielle chirurgische Verfahren beschränkt wird. Eine ähnliche Methode, die laserdesorptionionistionionization mass spectrometry (LDI-MS)⁷genannt wird, ist eine andere Technik, die nicht invasiv und nützlich für die Oberflächenanalyse ist. Da diese Technik gut beim Scannen der Oberfläche einer Probe ist, erreicht sie eine umfassende zweidimensionale Analyse wie die MALDI-Bildmassenspektrometrie^8,9. Da LDI-MS jedoch nur auf die Oberflächenanalyse anwendbar ist, ist PESI-MS vorteilhaft für die Analyse der Proben z.B. innerhalb des Gewebes. Eine andere Technik, der MasSpec Pen¹⁰, wurde berichtet, um eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit bei der Diagnose von Schilddrüsenkrebs zu erreichen, aber der Durchmesser der Sonde ist in der Größenordnung von mm und es ist spezifisch für die Oberflächenanalyse, was bedeutet, dass es nicht erkennen kann, kleine Knötchen von Krebs oder tief lokalisierte Läsionen. Da bei dieser Methode ein im Sondenstift eingebetteter Mikrokapillar-Durchflusskanal verwendet wird, muss die Kreuzkontamination, ähnlich wie Beil-MS, berücksichtigt werden. Es gibt andere Techniken, die auf klinische Umgebungen angewendet wurden, wie die Durchflusssonde und die Ionisationsform Tupfer¹¹, aber sie sind nicht weit verbreitet.

PESI ist die extreme Miniaturisierung von ESI, wobei die Kapillare des Nanoelektrosprays auf einer festen Nadel mit einem Spitzenkrümmungsradius von mehreren hundert nm konvergiert. Die Ionisation erfolgt im extrem eingeschränkten Bereich der Nadelspitze durch Bildung eines Taylor-Kegels, auf dem Proben verbleiben, bis die Ionisierung der gesamten Flüssigkeit auf der Spitze abgeschlossen ist¹². Bleibt der Analyt an der Spitze der Metallnadel, wird an der Schnittstelle zwischen metallener Nadel und den Analyten kontinuierlich eine Überladung erzeugt. Daher erfolgt die sequentielle Ionisierung von Molekülen in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenaktivität. Diese Eigenschaft macht die Nadelspitze zu einer Art Chromatogramm, das die Analyten je nach Oberflächenaktivität trennt. Technisch gesehen kommen Moleküle mit der stärkeren Oberflächenaktivität an die Oberfläche des Taylor-Kegels und werden früher ionisiert als Moleküle mit schwächerer Oberflächenaktivität, die bis zum Ende des Ionisationsprozesses an der Oberfläche der Nadel haften. So wird eine vollständige Ionisierung aller Moleküle erreicht, die von der Nadel aufgenommen werden¹³. Da diese Technik nicht die Zugabe von überflüssigem Lösungsmittel in die Probe beinhaltet, reichen mehrere hundert Femtoliter aus, um Massenspektren stark genug für weitere Analysen zu erhalten¹⁴. Diese Eigenschaften sind vorteilhaft für die Analyse intakter biologischer Proben. Ein großer Nachteil von PESI-MS liegt jedoch in der Diskontinuität bei der Ionisierung aufgrund der Hubbewegung der Nadel entlang der vertikalen Achse, ähnlich einer Sägemaschine. Die Ionisierung findet nur statt, wenn die Spitze der Sonde den höchsten Punkt erreicht, wenn die Höhe der Ionenöffnung an der horizontalen Achse ausgerichtet ist. Die Ionisierung hört auf, während die Nadel Proben aufnimmt, und so ist die Stabilität der Ionisierung nicht gleich der des konventionellen ESI. Daher ist PESI-MS keine ideale Methode für Proteomik.

Bislang wurde PESI-MS hauptsächlich auf die Analyse biologischer Systeme angewandt, die ein breites Spektrum von Bereichen von der Grundlagenforschung bis hin zu klinischen Umgebungen abdecken. Zum Beispiel konnte die direkte Analyse des menschlichen Gewebes, das während der Operation vorbereitet wurde, die Ansammlung von Triacylglycerol sowohl bei Nierenzellkarzinom¹⁵ als auch bei Pharyngeal-Plattenkarzinom¹⁶aufdecken. Diese Methode kann auch flüssige Proben messen, wie Blut, um sich auf das Lipidprofil zu konzentrieren. Zum Beispiel wurden einige Moleküle während der Ernährungsumstellung bei Kaninchen abgegrenzt; Es wurde berichtet, dass einige dieser Moleküle in sehr frühen Stadien der Experimente abnahmen, was auf die hohe Empfindlichkeit und Nützlichkeit dieses Systems für die klinische Diagnose¹⁷hindeutet. Darüber hinaus ermöglichte die direkte Anwendung auf ein lebendes Tier den Nachweis biochemischer Veränderungen der Leber nach nur einer Fastennacht⁵. Zaitsu et al.¹⁸ besuchten dieses Experiment⁵ und analysierten die Stoffwechselprofile der Leber fast auf die gleiche Weise, mit Ergebnissen, die die Stabilität und Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Methode verstärkten. Darüber hinaus konnten wir das Krebsgewebe aus der umgebenden nicht-kanzerösen Leber bei Mäusen mit dieser Technik unterscheiden¹⁹. Daher ist dies eine vielseitige Massenspektrometrie-Technik, die in verschiedenen Umgebungen nützlich ist, sowohl in vivo als auch in vitro. Aus einem anderen Blickwinkel kann das PESI-Modul durch Einstellen der Montagebefestigung für verschiedene Massenspektrometer geeignet werden. In diesem kurzen Artikel stellen wir die Grundlagen und Beispiele von Anwendungen vor (Abbildung 1), einschließlich Anwendungen mit lebenden Tieren⁵.

Gemäß den Vorschriften und Gesetzen in jedem Land müssen Teile dieses Protokolls überarbeitet werden, um die Kriterien der einzelnen Institutionen zu erfüllen. Die Anwendung auf den lebenden Organismus ist die interessanteste und herausforderndste, weil es biochemische oder metabolische Veränderungen in Geweben oder Organen bei lebenden Tieren in situ liefern kann. Während dieser Antrag vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege an der Universität Yamanashi genehmigt wurde, wird 2013⁵eine weitere Genehmigungsrunde notwendig sein, da die Vorschriften für die Tierversuche kürzlich geändert wurden. Daher sind mehrere Änderungen des Versuchsschemas ratsam. In Bezug auf die in Experimenten gewonnenen Massenspektren gibt es unter Berücksichtigung der Schwankungen der Massenspektren zwischen den einzelnen Messungen kein System für den Austausch spektraler Informationen, das der Nukleotid-Sequenzierungsgemeinschaft gemeinsam ist. Beim Umgang des Bedieners mit der Nadel ist vorsichtshalber, um Nadelstiche zu vermeiden, insbesondere beim Entfernen der Nadel aus dem Nadelhalter. Ein spezielles Gerät zum Lösen der Nadel ist sehr nützlich für diesen Zweck. Da es sich bei dem Fach des PESI-Moduls um eine luftdichte, geschlossene Kammer handelt, kommt es nicht zu Leckagen der Ionenfahne, wenn das Massenspektrometer gemäß den Anweisungen betrieben wird.