A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE definitely ) in Cancers A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdefinitely) in Cancers
概要
Le protocole détaille un modèle in vitro de carcinome murine de l’allongement défectueux non génétique de transcription. Ici, l’inhibition chronique de CDK9 est employée pour réprimer l’allongement productif de l’ARN Pol II le long des gènes pro-inflammatoires de réponse pour imiter et étudier le phénomène cliniquement surdes tecertainement, présent dans environ 20% de tous les types de cancer.
Abstract
Nous avons précédemment rapporté qu’un sous-ensemble de cancers est défini par des déréglementations transcriptionnelles globales avec des insuffisances répandues dans l’allongement de transcription d’ARNm (TE)-nous appelons tels cancers comme TEcertainement. Notamment, les cancers de TE sontcertainement caractérisés par la transcription fausse et le traitement défectueux d’ARNm dans un grand ensemble de gènes, tels que l’interféron/JAK/STAT et les voies de TNF/NF-B, menant à leur suppression. Lesous-type te des tumeurs dans le carcinome rénal de cellules et les patients métastatiques de mélanome sensiblement corrélés avec la réponse et les résultats pauvres dans l’immunothérapie. Compte tenu de l’importance d’étudier les cancers DE l’TE, car il laisse présager un obstacle important contre l’immunothérapie, l’objectif de ce protocole est d’établir un modèle in vitro TEdéfinitivement souris pour étudier ces répandues, non-génétique anomalies transcriptionnelles dans les cancers et d’acquérir de nouvelles idées, de nouvelles utilisations pour les médicaments existants, ou de trouver de nouvelles stratégies contre ces cancers. Nous détaillons l’utilisation de l’inhibition chronique de CDK9 de flavopiridol négociée pour abroger la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de la polymérase II d’ARN (RNA Pol II), supprimant la libération de l’ARN Pol II dans la transcription productive Allongement. Étant donné que les cancers TE ne sontcertainement pas classés sous une mutation somatique spécifique, un modèle pharmacologique est avantageux, et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. L’utilisation d’une dose sublétale optimisée de flavopiridol est la seule stratégie efficace dans la création d’un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l’allongement de la transcription et les défauts de traitement de l’ARNm, imitant étroitement l’ETe observé cliniquement certainement des caractéristiques. Par conséquent, ce modèle de TE peutcertainement être exploité pour disséquer, les facteurs cellulaires autonomes leur permettant de résister à l’attaque cellulaire à médiation immunitaire.
Introduction
Une étape de limitation de taux clé dans l’expression de presque tous les gènes actifs est la transition de la polymérase D’ARN II (ARN Pol II) de la pause promoteur-proximale à l’allongement productif1,2. Étant donné que la dysrégulation épigénétique de l’allongement transcriptionnel aide à la progression de multiples malignités humaines définies comme TEdéfinitivement, conduisant à la signalisation sous-optimale dans les voies de réponse pro-inflammatoires équivalant à une mauvaise réponse et les résultats à l’immunothérapie3, l’objectif global de ce protocole est d’établir un modèle in vitro utile pour étudier ces anomalies transcriptionnelles non génétiques répandues dans les cancers. Dans cette optique, l’utilisation de l’inhibition pharmacologique chronique du CDK9 est une stratégie efficace pour créer un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l’allongement de la transcription et les défauts de traitement de l’ARNm. La raison d’être de l’utilisation chronique de l’inhibition du CDK9 est qu’elle abroge la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de l’ARN Pol II, réprimant ainsi la libération de l’ARN Pol II dans l’allongement productif de transcription. En outre, TEcertainement cancers, décritprécédemments par notre groupe3,ne sont pas classifiés sous n’importe quelle mutation somatique spécifique. Par conséquent, un modèle non génétique (pharmacologique) est avantageux et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. La méthode ici détaille la génération et la caractérisation du modèle chronique de traitement de flavopiridol des cellules cancéreuses de murine. Cette méthode perturbe manifestement l’allongement de la transcription le long des gènes caractérisés par des longueurs génomiques plus longues, avec des promoteurs en équilibre et des expressions inductibles telles que le TNF/NF-B et la signalisation interféron/STAT, profondément contrôlée au niveau de transcription elongation3,4,5. Dans l’ensemble, ce modèle optimisé de ligne cellulaire murine des défauts d’allongement transcriptionnel-le seul modèle à notre connaissance pour étudier les tumeurs nouvellement décrites de TEcertainement-conduit la résistance à l’attaque immunitaire anti-tumorale, rendant un système utile pour exploiter et examiner les vulnérabilités des défauts non génétiques dans les machines de transcription de base dans les cancers vis-à-vis de l’attaque cellulaire à médiation immunitaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le contrôle de l’allongement de l’ARN Pol II est apparu comme un levier décisif pour réguler l’expression des gènes sensibles au stimulus au profit des cellules malignes5,7,8. Surmonter promoteur-proximal pause à l’allongement et la production d’ARNm ultérieure nécessite l’activité kinase de P-TEFb9,10,11. Notre modèle utilise …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été en partie soutenu par NCI (CA193549) et CCHMC Research Innovation Pilot Awards à Kakajan Komurov, et Department of Defense (BC150484) prix à Navneet Singh. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut national du cancer ou le ministère de la Défense. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
参考文献
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