الكشف عن مجموعه Hemolymph والتلقيح من المسام البدائية ميتارهيميوم في القراد Microplus Rhipicppus نحو دراسات علم الامراض لافقاريات
概要
تحليل القراد الهيموليمف يمثل مصدرا هاما للمعلومات حول كيفيه بعض مسببات الامراض تسبب المرض وكيف القراد الاستجابة المناعية لهذه العدوى. توضح الدراسة الحالية كيفيه تطعيم المروج الفطرية وجمع الأورام اللمفية من الإناث المجهرية الصغيرة.
Abstract
القراد هي إلزام همتوفغوس طفيليات و rhipicephalus ميكروبلاس له اهميه كبيره في الطب البيطري لأنه يسبب فقر الدم ، وفقدان الوزن ، وانخفاض قيمه الجلد الحيوانية وأيضا يمكن ان تكون بمثابه ناقل للعديد من مسببات الامراض. بسبب التكاليف الباهظة للسيطرة علي هذه الطفيليات ، والاضرار التي لحقت البيئة الناجمة عن الاستخدام غير المناسب لمبيدات آلافات الكيميائية ، وزيادة المقاومة ضد الطفيليات التقليدية ، والسيطرة البديلة من القراد ، من خلال استخدام الفطريات الحشرية ، علي سبيل المثال ، وقد اعتبر نهجا مثيرا للاهتمام. ومع ذلك ، أظهرت دراسات قليله كيف يعمل جهاز المناعة في القراد لمحاربه هذه المركبات الحشرية. ولذلك ، يوضح هذا البروتوكول طريقتين المستخدمة لتلقيح الحشرات في الإناث محتقن واثنين من التقنيات المستخدمة لجمع الهيموليمف وحصاد الخلايا الدموية. التلقيح من مسببات الامراض في الادراج الساق في الجسم الإناث القراد يسمح تقييم المعلمات البيولوجية الإناث علي عكس التلقيح بين الشجار والاستسلام ، والتي كثيرا ما تضر الجهاز Gené’s. وقد أسفرت مجموعه الأورام اللمفية الظهرية عن انتعاش أكبر في الحجم من الجمع عبر الساقين. وتشمل بعض القيود من جمع الهيموليمف القراد ومعالجه ط) معدلات عاليه من اضطراب الخلايا الدموية ‘ ، 2) التلوث النصفي مع الأمعاء المعطلة ، والثالث) انخفاض الانتعاش حجم الهيميميمف. عندما يتم جمع الهيموليمف من خلال قطع الساق ، يستغرق الوقت المستغرق في التراكم في الساق ، ويفضل عمليه التخثر. بالاضافه إلى ذلك ، يتم الحصول علي عدد اقل من الخلايا الدموية في المجموعة من خلال الساق مقارنه بالمجموعة الظهرية ، علي الرغم من ان الطريقة الاولي تعتبر أسهل في الأداء. فهم الاستجابة المناعية في القراد بوساطة وكلاء الحشرات يساعد علي كشف النقاب عن المرض وتطوير أهداف جديده للسيطرة علي القراد. عمليات التلقيح الموصوفة هنا تتطلب موارد تكنولوجية منخفضه جدا ويمكن استخدامها ليس فقط لفضح القراد إلى الكائنات المجهرية المسببة للامراض. المثل ، فان مجموعه من القراد الهيموليمف تمثل الخطوة الاولي للعديد من الدراسات الفسيولوجية.
Introduction
القراد الماشية ، rhipicpasus ميكروبلاس، هو المري ectoparite مع تاثير سلبي هائل علي الماشية في المناطق الاستوائية. هذا القراد هو المتجه من العوامل المسببة للامراض مثل babesia بوفيس]، babesia bigemina، والهامشية انبلازما انه ، بالاضافه إلى الضرر المباشر الأرقاء ، يمكن ان تقلل من إنتاج الحليب واللحوم ، وتسبب فقر الدم والموت في نهاية المطاف. وقدرت الخسائر الناجمة عن هذا الطفيليات في 3,240,000,000 دولار سنويا في البرازيل1. ويطلب اتباع أساليب مستدامه ويعتبر استخدام عوامل الحشرات الحشرية بديلا واعدا للحد من استخدام مبيدات الجراثيم الكيميائية2،3،4.
الفطريات الحشرية ، مثل Metarhizium spp. ، هي أعداء طبيعيه من المفصليات بما في ذلك القراد ، وبعض العزلات يمكن استخدامها كمتحكمات حيوية. هذه الممرضات تصيب بنشاط المضيف من خلال اهاب واستعمار الجسم2,5,6. ومع تطور العدوى ، يتم التوسط في الاستجابات الخلوية والخلطيه من خلال نظام المناعة القراد. تم الإبلاغ عن تحليل القراد الهيموليمف كاداه مفيده لتقييم الاستجابات المناعية بعد التحدي مع مسببات الامراض7,8.
وتنقسم استجابه المفصليات المناعية إلى استجابات الخلطيه والخلوية. وتنطوي الاستجابة الحميدة علي عمليات التراص الدموي وإنتاج البروتينات/الببتيدات المضادة للميكروبات ، في حين يتم تنفيذ الاستجابة المناعية الخلوية من خلال الخلايا الدموية. هذه الخلايا موجودة في الجسم اللمفي من جميع المفصليات ويقال لتطوير دور تعبيري في الدراسات التي تنطوي علي الاستجابة المناعية الفطرية9، كما انه يرتبط مباشره إلى كثرة الكريات وعمليات التغليف. وفقا لذلك ، يمكن ان تساعد الدراسات حول الخلايا الدموية في التحقيق في مسار الموت وفهم العمليات مثل الفحص الألى ، المبرمج ، والنخر. في بعض لافقاريات كصمامات ، تواجه مجموعه الخلايا الدموية قيودا مثل انقطاع الخلايا ، وانخفاض حجم الخلايا الدموية التي تم الحصول عليها ، وتركيز منخفض للخلايا المستردة10. في كثير من الأحيان ، اعتمادا علي المنهجية المطبقة ، يتم الحصول علي انخفاض تركيز الخلايا ، مما يؤثر مباشره علي القياس الكمي للخلايا وتحليلها.
عدد الخلايا الدموية المتداولة في الهيموسيفي هو متغير بين المفصليات المختلفة ، ويمكن ان تتغير في نفس النوع بسبب مراحل فسيولوجية مختلفه مثل الجنس ، والعمر ، والمرحلة التنموية المفصلية11. يمكن أيضا العثور علي الخلايا الدموية الانضمام إلى بعض الأعضاء ويتم الإفراج عنهم في الدورة الدموية فقط بعد عمليه العدوى11. ومع ذلك ، أبلغت معظم الدراسات عن استخدام الحشرات ، في حين لا تزال القراد اقل استكشافا فيما يتعلق بفسيولوجيتها وعلم الامراض. علي الرغم من التلقيح الممرض وجمع الهيموليمف في القراد هي تقنيات اقل استخداما ، وإنشاء أساليب قياسيه تساعد علي تطوير دراسات أكثر دقه.
وكان الهدف من هذه الدراسة للمقارنة بين الطرق الأكثر استخداما لجمع البوليمرات الدموية والتلقيح من مسببات الامراض في R. ميكروبلاس القراد ، وتقييم الفعالية في اكتساب الخلايا الدموية وتركيز الكريات الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التلقيح من مسببات الامراض مفيد عندما تهدف الدراسة إلى التحقيق في العمل المجري من الكائنات المجهرية في نماذج المفصليات التجريبية لأنه يؤكد ان الممرض هو داخل المضيف. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية لتطعيم جزيئات مثل تداخل RNA (RNAi). اعتبرت تلقيح بين ال [سكوتثم] واستسلام يكون يسهل ان ينجز غير ان غا?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل الcoordenacão العليا (الرؤوس) من البرازيل ، والقانون المالي 001. قدمت الرؤوس منحه الدكتوراه لa.f. Marciano. نشكر المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية في البرازيل علي تقديم منحه الدكتوراه ل j. Fiorotti. وكان هذا البحث مدعوما أيضا بمنح من مؤسسه كارلوس تشاغف# يلهو للبحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ) و CNPq. V.R.E.P. Bittencourt هو باحث CNPq.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
参考文献
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
