Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

1. Búferes y soluciones comunes que se utilizarán Preparar medio de tuberculosis: Caldo estupendo (24 g/L extracto de levadura; 20 g/L de tripato; 4 ml/l glicerol; 0,017 M KH2PO4; y 0,072 M K2HPO4). Las soluciones 0.017 M KH2PO4 y 0.072 M K2HPO4 se pueden comprar como un búfer de fosfato de 10x (0,17 M KH2PO4 y 0,72 M K2HPO4). Preparar medio LB: Luria-Bertani (5 g/L extracto de levadura; 10 g/L de triptona; y 10 g/L NaCl). Ajuste el pH a 7,0 con 5 M NaOH. Prepara 1x TBS: Solución salina tristamponada (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH a 7,5; 150 mM de NaCl). Preparar 1x TBST: TBS complementado con 0.1% Tween 20. 2. Preparación del ADN NOTA: El ADN utilizado para las matrices NAPPA debe ser altamente puro; por lo tanto, no se recomiendan mini-preparaciones comerciales de ADN. Actualmente, se utilizan dos protocolos para la preparación del ADN: en casa mini-preparación de alto rendimiento (descrito aquí) o comercial Midi- o Maxi-prep. El rendimiento medio del protocolo de preparación mini interno es de 1.500 muestras al día por persona. Crecimiento bacteriano para mini-preparación interna de alto rendimiento Prepare la placa LB/Agar omni. Vierta 30–40 ml de agar LB (1,5 % agar bacteriológico en medios LB complementados con antibióticos para la selección de clones positivos) en cada placa de pozo individual. Material de glicerol puntual en la placa LB/agar. Diluir el material de glicerol en medios DE LB (1:300, por lo general 2 l en 600 l de LB). Agitar durante 10 minutos. Incubar a 37oC, boca abajo, durante la noche. Inocular culturas. Usando el dispositivo de 96 pines que fue esterilizado en 80% etanol y llama, inocular el cultivo de la placa de agar en un bloque de pozo profundo con 1,5 ml por pozo de medio de tuberculosis complementado con antibióticos. Cultivos incubados. Cubra el bloque con un sello permeable al gas e incubar durante 22–24 h a 37 oC, 300–800 rpm dependiendo del agitador.NOTA: Los agitadores ajustados a 800 rpm son óptimos para esta incubación. El uso de un agitador de velocidad más lento puede resultar en cultivos menos densos y menores rendimientos de purificación de ADN. Cultivos de pellets. Bloques de giro a 3.800 x g y 4 oC durante 30 min. Deseche el sobrenadante. Mini-preparación interna de alto rendimientoNOTA: Los pipetadores multicanal o los dispensadores automáticos se pueden utilizar para realizar la minipreparación interna de alto rendimiento. Si utiliza un dispensador automático, asegúrese de limpiar el sistema antes de usar y entre soluciones.Prepare todas las soluciones utilizadas durante la minipreparación: Solución de preparación 1: Tampón de resuspensión TE (50 mM Tris, pH a 8,0; EDTA de 10 mM, pH a 8,0; 0,1 mg/ml de ARNI). Conservar a 4oC. Preparar la solución 2: buffer de lisis NaOH/SDS (0,2 M NaOH; 1% SDS). Para obtener mejores resultados, se debe utilizar una solución recién hecha. Preparar la solución 3: búfer de neutralización KOAC (2,8 M KOAc). Ajuste el pH de la solución a 5.1 con ácido acético glacial. Conservar a 4oC. Preparar la solución N2: búfer de equilibrio (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0.15% Triton X-100). Ajuste el pH de la solución a 6.3 con ácido fosfórico. Preparar la solución N3: búfer bash (100 mM Tris; 1.15 M KCl; 15% EtOH). Ajuste el pH de la solución a 6.3 con ácido fosfórico. Preparar la solución N5: búfer de elución (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Ajuste el pH de la solución a 8,5 con ácido fosfórico.NOTA: El control exitoso de la unión al ADN, el lavado y la elución durante el intercambio de aniones depende en gran medida de la concentración de KCl tampón y de los valores de pH. Las mediciones cuidadosas de los componentes del tampón y el ajuste del pH son esenciales. Las pequeñas desviaciones de las mediciones descritas pueden dar lugar a una pérdida significativa de los rendimientos. Vuelva a suspender el perdigón. Añadir 200 l de solución 1 y agitar a 2.000 rpm durante 5 minutos a RT. La resuspensión completa del pellet es necesaria para una lisis exitosa. Vortex el bloque si es necesario. Bacterias Lyse. Añadir 200 s de solución 2, sellar la placa con un sello de aluminio e invertir 5x. Tiempo cuidadosamente este paso desde el principio de la adición de la solución 2. No exceda los 5 min. Neutralizar la solución. Añadir 200 s de solución 3, sellar la placa con un sello de aluminio e invertir 5x. El sello puede estar suelto debido a los búferes de lisis/neutralización, así que tenga cuidado al invertir. Se recomienda una inversión parcial, en la que la solución nunca toca el sello, para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. Lisado claro. Centrifugar las placas a 3.800 x g y 4oC durante 30 min. Preparar lodos de resina de intercambio de aniones durante el paso de centrifugación de peletización de lisado. Con una botella de 1 L, llénela con la resina de intercambio de aniones hasta que alcance la marca de 300 ml y, a continuación, añada la solución N2 hasta 900 ml.ADVERTENCIA: Este paso debe realizarse en la campana para proteger contra la inhalación de sílice. Preparar placas de resina de intercambio de aniones. Apilar las placas de filtro en la parte superior de un bloque de pozo profundo para actuar como un recipiente de recogida de residuos. Mezclar la suspensión de intercambio de aniones hasta que sea homogéneo, luego verter en una vaguada de vidrio. Usando puntas P1000 de gran aburra, transfiera 450 sL de la suspensión a cada pocil de las placas de filtro. Placas apiladas de centrífuga (placa de resina/placa de pozo profundo) a aceleración lenta durante 5 min a 130 x g y RT. Deseche el flujo a través. Transfiera el sobrenadante de lysato a la placa de resina/pilas de bloques de pozoprofundo profundo. Gire las placas apiladas durante 5 minutos a 30 x g con velocidad de rampa lenta. Lave la columna. Añadir 400 l de solución N3 (tampón de lavado) a cada poca. Transfiera la placa de resina al colector de vacío para eliminar el tampón de lavado. Repita los pasos de lavado 3x. En el último lavado, asegúrese de que todos los pozos estén correctamente vaciados. Gire las placas de pila a 150 x g durante 5 min para eliminar cualquier búfer residual. Elute ELADN. Coloque la placa de resina en una placa de recogida limpia de 800 ml. Añadir 300 s l de solución N5 a cada poca. Deje que se sente en RT durante 10 minutos, luego gire las placas apiladas durante 5 minutos a 20 x g con velocidad de rampa lenta. Gire las placas apiladas durante 1 min a 233 x g. Cuantifique el ADN y almacene las placas a -20 oC hasta su uso posterior o proceda directamente a la precipitación del ADN.NOTA: Se hace necesario un mínimo de 30 g de ADN por muestra. Si el rendimiento del ADN es bajo, se recomienda repetir la minipreparación del ADN, o alternativamente combinar dos placas durante el paso de precipitación (sección 2.3). Precipitaciones de ADN Descongelar las placas, el vórtice para homogeneizar la solución de ADN y girar a 230 x g durante 30 s para recoger toda la solución en la parte inferior del pozo. Añadir 40 sl de NaOAc de 3 M y 240 l de isopropanol a cada poca. Cubra la placa con un sello de aluminio y mezcle invirtiendo 3x. Centrifugar las placas a 30 min a 3.800 x g y 25oC. Deseche cuidadosamente el sobrenadante.NOTA: Para combinar dos placas, transfiera el ADN de la segunda placa al pellet desde la primera placa y repita los pasos 2.3.2–2.3.3. Lavar y precipitar el ADN. Añadir 400 l de 80% de etanol a cada poca. Sellar las placas con sello de aluminio y agitar a 1.000 rpm durante 30 min. Centrifugar a 3.800 x g durante 30 min a 25oC. Descarta el sobrenadante. Seque los pellets de ADN. Coloque las placas boca abajo en un ángulo sobre las toallas de papel y déjelas secar durante 1-2 h, hasta que no haya alcohol en la parte inferior del pozo. Sellar y centrifugar a 230 x g durante 2 min para bajar los pellets. Una vez que las placas estén secas, selle con sello de aluminio y congele a -20 oC para su uso posterior o continúe resuspendiendo el ADN (paso 4.1). 3. Recubrimiento de diapositivas Aminosilane Coloque los portaobjetos de vidrio en un bastidor de metal. Inspeccione visualmente cada diapositiva para asegurarse de que no haya arañazos ni imperfecciones. Sumerja las guías en solución de recubrimiento (2% reactivo aminosilano en acetona) durante 15 minutos mientras se balancea. La solución aminosilane se puede utilizar para recubrir dos bastidores de 30 portaobjetos cada uno antes de que necesite ser desechado. Enjuague el paso. Sumerja el portaobjetos en el lavado de acetona (99% acetona), agite hacia adelante y hacia atrás, luego hacia arriba y hacia abajo rápidamente 5 veces. Incline a una esquina para gotear, luego sumergirse en agua Ultrapure hacia arriba y hacia abajo rápidamente 5x. Inclina para gotear, luego coloca en servilletas.NOTA: El lavado de acetona se puede utilizar dos veces, mientras que el agua ultrapura debe cambiarse cada vez. Seque los portaobjetos con aire a presión, soplando sobre ellos desde todos los ángulos durante aproximadamente 3 minutos hasta que se hayan eliminado todas las gotas de agua. Guarde los portaobjetos recubiertos en RT en un estante de metal dentro de una caja herméticamente sellada. 4. Preparación de la muestra de matriz Resuspenda el pellet de ADN de la minipreparación interna (paso 2.3.6) en 20 l de agua ultrapura y agite a 1.000 rpm durante 2 horas. Para el ADN de preparación midi/max, diluir cada muestra a una concentración final de 1,5 g/L y transferir 20 ml a una placa de recogida de 800 ol. Prepare la mezcla de impresión. Para una placa de 96 pocillos, prepare 1 ml de mezcla de impresión [237,5 l de agua ultrapura; 500 ml de polilisina (0,01%); 187,5 l de BS3 (bis-sulfosuccininiminyl, 50 mg/ml en DMSO); y 75 ml de anticuerpo policlonal anti-bandera de conejo)].NOTA: Los productos químicos deben añadirse en el orden especificado para evitar precipitaciones. Agregue 10 ml de mezcla de impresión a cada muestra, selle las placas con papel de aluminio y agite a RT durante 90 minutos a 1.000 rpm. Almacene las placas durante la noche (16 h) a 4 oC. El día de la impresión, reórtice brevemente y gire las placas. Transfiera 28 l de cada muestra a una placa de matriz 384. Esta transferencia se puede realizar mediante automatización o una pipeta multicanal. Es crucial realizar un seguimiento de la posición de las muestras en la placa de matriz 384. Gire la placa hacia abajo brevemente para eliminar cualquier burbuja. Selle las placas con papel de aluminio. 5. Generación de arreglos NAPPA: impresión de microarrays NOTA: Todas las condiciones de impresión se optimizaron para el instrumento que aparece en la Tabla de Equipos y Materiales. Si utiliza una matriz diferente, puede ser necesaria una optimización adicional. Limpieza del arreglo de discos. Antes de empezar, vacíe todos los depósitos de residuos y rellene los depósitos con agua ultrapura o 80% etanol, si es necesario. Limpie los pasadores uno por uno con toallitas sin pelusas y agua ultrapura. Seque los pasadores con toallitas libres de pelusas y colóquelos cuidadosamente en la cabeza del saqueador. Configuración del arrayer: especificaciones de impresión [número máximo de sellos por tinta: 1; número de sellos por punto: 1; sincronización de múltiples sellos: –; tiempo de sello (ms): 0 ms; tiempo de entrada (ms): 0 ms; ajuste de profundidad de impresión: 90 micras; número de touch-offs: 0]. protocolo de esterilización: lavado de agua ultrapuro durante 2.000 ms con 0 ms de tiempo de secado y 500 ms de tiempo de espera; repetir estos pasos 6x; seguido de lavado con 80% de etanol durante 2.000 ms con 1.200 ms de tiempo de secado y 500 ms de tiempo de espera; repetir estos pasos 6x. Diseño de diapositivas: configure el arrayer con el patrón de matriz deseado. El diseño debe tener en cuenta varios factores [es decir, el número de réplicas para cada muestra, ubicación y número de características de control, diseño de matriz (un bloque, varios bloques idénticos), número de matrices que se van a imprimir, longitud de la ejecución, etc.]. Coloque los portaobjetos recubiertos de aminosilano (paso 3.4) en la cubierta del bardero. Compruebe si el vacío mantiene todas las diapositivas firmemente en su lugar. Encienda el humidificador (debe ajustarse al 60%). Coloque la placa de pozo 384 en la cubierta del arreglo de discos. Inicie el programa. Etiquete los microarrays. Cuando haya terminado de imprimir, coloque las etiquetas de diapositiva sin diapositivas en la parte inferior (no impresa) de cada diapositiva. Mantenga el orden de impresión de diapositivas en la cubierta en orden numérico. Almacene las matrices impresas en RT en un bastidor de metal dentro de una caja herméticamente sellada con un paquete de sílice. Las diapositivas mantenidas en un entorno seco tienen una vida útil de hasta un año. (Opcional): se puede imprimir un segundo lote de 90 diapositivas utilizando las mismas muestras. Para ello, retire la placa de pozo 384 de la cubierta del arrayer tan pronto como se haga la impresión de la placa. Sellar y guardar la placa a 4oC. Después de que el primer lote de matrices esté completamente hecho, retírelos de la cubierta, coloque nuevas diapositivas recubiertas de aminosilano e inicie una nueva carrera. Asegúrese de que cada placa de pozo 384 está en RT durante 30 minutos antes de su uso. Si se imprimen más de cuatro réplicas por muestra en un lote de diapositivas, se recomienda dividir las 384 placas de pozo en dos placas para disminuir la evaporación de la muestra al disminuir la cantidad de tiempo invertido en la cubierta del arreglo de discos.NOTA: Compruebe todos los depósitos antes del comienzo de la segunda ejecución. 6. Detección de ADN en diapositivas NAPPA Bloquee las diapositivas. Coloque las diapositivas en una caja de pipetas y agregue 30 ml de búfer de bloqueo. Incubar a RT durante 1 h en una coctelera mecedora. Mancha las diapositivas. Deseche la solución de bloqueo y agregue 20 ml de tampón de bloqueo y 33 ml de tinte fluorescente intercalante de ADN. Incubar durante 15 min con agitación. Luego, enjuague rápidamente los portaobjetos con agua ultrapura y séquelos con aire a presión. Continúe con el escaneo (sección 11). 7. Expresión de diapositivas NAPPA Bloquee las diapositivas con tampón de bloqueo en una coctelera de balanceo a RT durante 1 h. Utilice aproximadamente 30 ml en una caja de pipetas para cuatro diapositivas. Enjuague los portaobjetos con agua ultrapura y séquelos con aire comprimido filtrado. Aplique la junta de sellado a cada portaobjetos según las instrucciones del fabricante. Añadir mezcla IVTT. Cada diapositiva requerirá 150 l de mezcla IVTT. Diluir 82,5 l de lisato de HeLa en 33 ol de agua DEPC y complementar con 16,5 ol de proteínas accesorias y 33 uL de mezcla de reacción. Agregue la mezcla IVTT del extremo no etiquetado o no espécimen. Pipetear la mezcla lentamente (es aceptable si se abaloce temporalmente en el extremo de entrada). Masajee suavemente la junta de sellado para que la mezcla IVTT se extienda y cubra toda el área de la matriz. Aplique los sellos de puerto redondo pequeño a ambos puertos. Coloque las diapositivas en un soporte y transfieralas a la incubadora de refrigeración programable. Incubar durante 90 min a 30oC para la expresión proteica, seguido de 30 min a 15oC para la inmovilización de la proteína de consulta. Lave y bloquee los portaobjetos. Retire la junta de sellado y sumerja los portaobjetos en una caja de pipeta con aproximadamente 30 ml de 1 TBST complementado con 5% de leche para la visualización de proteínas (sección 8) o 1 x TBST complementado con 3% de albúmina sérica bovina (BSA) para ensayos de quinasa o cribado de drogas (sección 9). Incubar a RT con agitación durante 20 min y repetir este paso 2x. 8. Detección de proteínas en matrices NAPPA Añadir anticuerpo primario. Retire las diapositivas de la solución de bloqueo (paso 7.5) y seque suavemente la parte posterior (lado no impreso) con una toalla de papel. Colocar las diapositivas sobre un soporte y aplicar 600 ml de anticuerpo primario (ratón anti-bandera) diluido 1:200 en 1 x TBST + 5% de leche. Incubar durante 1 h a RT. Lave los portaobjetos con 1 x TBST + 5% de leche en una coctelera mecedora (3x para 5 min cada una). Añadir anticuerpo secundario. Retire los portaobjetos de la solución de lavado y seque suavemente la parte posterior con una toalla de papel. Colocar las diapositivas sobre un soporte y aplicar 600 ml de anticuerpo secundario (anticuerpo antiratón con labbeled cy3) diluido 1:200 en 1 x TBST + 5% de leche. Proteja los portaobjetos de la luz e incubar durante 1 h a RT. Lave los portaobjetos con 1 TBST en una coctelera mecedora (3x para 5 min cada una). Enjuague rápidamente los portaobjetos con agua ultrapura y séquelos con aire a presión. Continúe con el escaneo (sección 11). 9. Examen del inhibidor de la tirosina quinasa en matrices NAPPA NOTA: Sin embargo, se pueden procesar varias diapositivas en el mismo experimento, asegúrese de que en cada paso, una diapositiva se procesa a la vez y que no se secan entre pasos. Agregue todas las soluciones al extremo no etiquetado o no espécimen de la diapositiva. Prepare todas las soluciones utilizadas durante el cribado de drogas: Preparar la solución de fosfatasa/DNase combinando lo siguiente: 1x tampón de metalofosfasa proteica (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.01% Brij 35 a pH a 7,5); 1 mM MnCl2; 8.000 unidades de proteína lambda fosfatasa; y 2 unidades de DNase I. Preparar 400 l de la solución para cada microarray. Añadir fosfatasa y DNase justo antes de su uso. Haga la dilución del medicamento. Los medicamentos se reconstituyen en DMSO a una concentración final de 10 mM. Para asegurar que todas las concentraciones de fármacos probadas en la matriz, asegúrese de que se crea el mismo volumen de DMSO (una acción de 10.000x en DMSO) para cada concentración y se mantiene en -80 oC. En el momento de su uso, los medicamentos se diluyen 1:100 en agua. Preparar la solución de fármaco/quinasa combinando lo siguiente: 1x tampón de quinasa (25 mM Tris-HCl de pH a 7,5); 5 mM beta-glucerofosfato; 2 mM De DTT; 0,1 mM Na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 M de ATP; y 2 l de fármaco (diluido 1:100 en agua). Preparar 200 ml de la solución para cada microarray. Realice el tratamiento con fosfatasa y DNase. Retire las diapositivas de la solución de bloqueo (paso 7.5) y seque suavemente la parte posterior con una toalla de papel. Coloque las diapositivas sobre el soporte y aplique 200 ml de solución de fosfatasa/DNase. Coloque un cubreobjetos de microarray para evitar la evaporación. Incubar a 30oC durante 45 min en el horno. Tratamiento con fosfatasa y DNase II: retirar las matrices del horno, desechar el cubreobjetos, eliminar el exceso de solución y aplicar 200 ml de fosfatasa recién hecha y solución de DNase. Cubrir los microarrays con cubreobjetos e incubar durante otros 45 min a 30oC en el horno. Lave los portaobjetos con 1 TBST + 0,2 M NaCl en una coctelera mecedora (3x para 5 min cada una). Realizar el tratamiento farmacológico y la reacción de la quinasa. Retire los portaobjetos de la solución de lavado y seque suavemente la parte posterior con una toalla de papel. Coloque las diapositivas sobre el soporte y aplique 200 ml de solución de droga/quinasa. Coloque un cubreobjetos en la parte superior para evitar la evaporación. Incubar durante 1 h a 30oC en el horno. Lave los portaobjetos con 1 TBST + 0,2 M NaCl en una coctelera mecedora (3x para 5 min cada una). Repita los pasos 8.1–8.4 usando como anticuerpo primario anticuerpo anti-phosho-Tyr anticuerpo diluido 1:100. Reemplace 1 x TBST + 5% de leche en todos los pasos con 1 x TBST + 3% de BSA. 10. Protocolo automatizado de hibridación NOTA: Alternativamente, una estación de hibridación se puede utilizar para automatizar todas las hibridaciones y lavados en los arreglos de discos NAPPA (secciones 7–9) y el protocolo se proporciona como Archivo Suplementario 1. 11. Adquisición de imágenes NOTA: Las imágenes de microarray deben adquirirse con una resolución de 20 micras o superior. Cargue microarrays en el cargador portaobjetos con las proteínas hacia arriba. Cargue el cargador en el escáner de microarray. Seleccione el láser verde con un filtro de emisión de 575/30 nm para escanear la señal del anticuerpo secundario etiquetado cy-3. Si se utiliza un fluoróforo diferente, seleccione el láser/longitud de onda correcto para detectar la señal del tinte fluorescente. Defina el nombre de cada imagen y la ubicación en la que se guardarán. (Opcional): para cada nuevo fluoróforo, se recomienda optimizar las condiciones de escaneo para detectar el rango lineal de la intensidad de la señal. Para ello, escanee un microarray utilizando una gama de fotomultiplicadores (PMT) y gane hasta que se obtenga una imagen clara con señal no saturada y fondo bajo. Escanee todos los microarrays con los ajustes optimizados y recuerde desactivar la ganancia automática.NOTA: Para el análisis de datos, todos los microarrays deben ser escaneados utilizando la misma configuración de escaneo. Para ensayos de quinasa que utilizan cy3 como fluoróforo, las imágenes se escanean con un 20% de PMT, una intensidad láser del 25% y 10 micras de resolución, utilizando el escáner que aparece en la Tabla de Equipos y Materiales. 12. Procesamiento y análisis de datos NOTA: Hay varios paquetes de software disponibles para la cuantificación de datos de microarray con capacidades similares. El procedimiento descrito aquí fue diseñado para el software enumerado en la Tabla de Equipos y Materiales. Cargue los archivos TIFF para cuantificarlos, diseñe la cuadrícula para que coincida con el diseño del microarray y ajuste el tamaño de los puntos para incorporar toda la señal con el área mínima posible. Las manchas vecinas no deben superponerse. Inspeccione visualmente el rendimiento del software y ajuste la cuadrícula manualmente, si es necesario. Cuantificar la intensidad de la señal del microarray. Inspeccione visualmente las manchas en busca de cualquier anomalía (encuadernación no específica, polvo, etc.) y retírelas del análisis de datos. Corrija el fondo localmente utilizando la señal de las áreas vecinas en la matriz en la que no hay punto presente. Normalizar datos. Para comparar la señal a través de diferentes matrices, se debe normalizar la intensidad de la señal de cada microarray. Para excluir los valores atípicos, normalice los datos utilizando la media recortada del 30% de la señal del control positivo (puntos IgG) de los microarrays defosforilados.NOTA: La señal del punto IgG no cambia durante la fosforilación y desfosforilación de los microarrays y es adecuada para la normalización. Identificar quinasas activas. Para cada entidad mostrada en el microarray, calcule la relación entre la intensidad de la señal normalizada en las matrices autofosforiladas y desfosforiladas. Establezca un umbral de 1,5 veces el cambio para la identificación de las quinasas activas y marque todas las demás características como incapaces de someterse a la autofosforilación (N/A). Calcular la actividad de cada quinasa identificada en el paso 12.5 como un porcentaje de la señal ajustada (intensidad de la señal de la matriz de control positivo normalizada (DMSO) restada por la intensidad de la señal de la matriz de control negativo normalizada (desfosforilada).