Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

1. buffers comuns e soluções a serem usadas Prepare o meio de TB: caldo fantástico (24 g/L extrato de levedura; 20 g/L de triptona; 4 mL/L de glicerol; 0, 17 M KH2po4; e 0, 72 m K2HPO4). As soluções 0, 17 MKH 2po4 e 0, 72 m k2HPO4 podem ser adquiridas como tampão fosfato 10x (0,17 m KH2po4 e 0,72 m k2HPO4). Prepare o meio LB: Luria-Bertani (5 g/L extrato de levedura; 10 g/L de triptona; e 10 g/L NaCl). Ajuste o pH a 7,0 com NaOH de 5 M. Prepare 1x TBS: solução salina tampão Tris (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH = 7,5; 150 mM NaCl). Prepare 1x TBST: TBS suplementado com 0,1% Tween 20. 2. preparação do ADN Nota: o DNA utilizado para matrizes NAPPA deve ser altamente puro; Conseqüentemente, os mini-Preps comerciais do ADN não são recomendados. Atualmente, dois protocolos para a preparação do ADN são usados: na mini-preparação high-throughput da casa (descrita aqui) ou MIDI-ou Maxi-Prep comercial. A taxa de transferência média do protocolo de mini-Prep em casa é de 1.500 amostras por dia por pessoa. Crescimento bacteriano para a mini-preparação da elevado-produção da em-casa Prepare a placa Omni LB/agar. Despeje 30 – 40 mL de agar LB (1,5% de agar bacteriológico em LB mídia suplementada com antibiótico para seleção de clones positivos) em cada placa de poço único. Manchar o estoque de glicerol na placa LB/agar. Diluir o estoque de glicerol no meio LB (1:300, geralmente 2 μL em 600 μL de LB). Agitar por 10 min. ponto 3 μL do estoque diluído na placa LB/agar. Incubar a 37 ° c, de cabeça para baixo, durante a noite. Inocular culturas. Usando o dispositivo 96-PIN que foi esterilizado em 80% etanol e chama, inocular a cultura da placa de agar em um bloco de poço profundo com 1,5 mL por poço de meio de TB suplementado com antibiótico. Incubar culturas. Cubra o bloco com um selo permeável a gás e incubar por 22 – 24 h a 37 ° c, 300 – 800 rpm, dependendo do Shaker.Nota: os abanadores ajustados em 800 rpm são ideais para esta incubação. O uso de um agitador de velocidade mais lento pode resultar em culturas menos densas e menores rendimentos de purificação de DNA. Culturas de pellets. Blocos da rotação em 3.800 x g e 4 ° c para o sobrenadante do descarte de 30 min. Mini-Prep em casa de alta taxa de transferênciaNota: pipetadores multicanal ou dispensadores automáticos podem ser usados para realizar a mini-preparação de alta taxa de transferência em casa. Se estiver usando um dispensador automático, certifique-se de limpar o sistema antes de usar e entre as soluções.Prepare todas as soluções utilizadas durante a minipreparação: Preparar solução 1: tampão de ressuscição TE (50 mM Tris, pH = 8,0; 10 mM EDTA, pH = 8,0; 0,1 mg/mL RNAse). Conservar a 4 ° c. Preparar solução 2: tampão de Lise NaOH/SDS (0,2 M NaOH; 1% SDS). Para melhores resultados, uma solução recém-feita deve ser usada. Prepare a solução 3: tampão de neutralização KOAC (2,8 M KOAc). Ajuste o pH da solução para 5,1 com ácido acético glacial. Conservar a 4 ° c. Preparar solução N2: tampão de equilíbrio (100 mM TRIS; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0,15% Triton X-100). Ajuste o pH da solução para 6,3 com ácido fosfórico. Prepare a solução N3: buffer bash (100 mM TRIS; 1,15 M KCl; 15% EtOH). Ajuste o pH da solução para 6,3 com ácido fosfórico. Prepare a solução N5: tampão de eluição (100 mM TRIS; 1 M KCl; 15% EtOH). Ajuste o pH da solução para 8,5 com ácido fosfórico.Nota: o controle bem sucedido da ligação, da lavagem, e da eluição do ADN durante a troca do aníon é altamente-dependente da concentração do tampão KCl e dos valores de pH. As medidas cuidadosas do componente tampão e o ajuste do pH são essenciais. Pequenos desvios das medições descritas podem resultar em perda significativa de rendimentos. Re-suspender pellet. Adicionar 200 μL de solução 1 e agitar a 2.000 rpm durante 5 min em RT. a re-suspensão completa da pelota é necessária para o lysis bem sucedido. Vortex o bloco, se necessário. Bactérias lyse. Adicione 200 μL de solução 2, sele a placa com um selo de alumínio e inverta 5x. Cuidadosamente tempo este passo desde o início da solução 2 adição. Não exceda 5 min. Neutralize a solução. Adicione 200 μL de solução 3, sele a placa com um selo de alumínio e inverta 5x. O selo pode ser solto devido aos buffers de Lise/neutralização, portanto, tenha cuidado ao inverter. Uma inversão parcial, na qual a solução nunca toca o selo, é recomendada para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. Lisado claro. Centrifugar as placas a 3.800 x g e 4 ° c durante 30 min. Prepare o chorume da resina da troca do aníon durante a etapa da centrifugação do lisate granulação. Usando um frasco de 1 L, encha-o com a resina da troca do aníon até que alcangue a marca de 300 mL, a seguir adicione a solução N2 até 900 mL.Cuidado: esta etapa deve ser feita no capô para proteger contra a inalação de sílica. Prepare placas de resina de troca de ânions. Empilhe as placas de filtro em cima de um bloco de poço profundo para atuar como um recipiente de coleta de resíduos. Misture a pasta de troca de ânions até que seja homogênea, em seguida, despeje em uma calha de vidro. Usando pontas largo-furadas de P1000, transfira 450 μL da pasta em cada poço das placas de filtro. Centrifugue placas empilhadas (placa da resina/placa profunda do poço) na aceleração lenta por 5 minutos em 130 x g e em RT. descarte o fluxo completamente. Transfira o sobrenadante do lisado à placa da resina/pilhas profundas do bloco do poço. Gire as placas empilhadas por 5 min a 30 x g com velocidade de rampa lenta. Coluna de lavagem. Adicionar 400 μL de solução N3 (tampão de lavagem) a cada poço. Transfira a placa de resina para o colector de vácuo para remover o tampão de lavagem. Repita as etapas de lavagem 3x. Na última lavagem, certifique-se de que todos os poços estão devidamente esvaziados. Gire as placas de pilha em 150 x g por 5 min para remover qualquer tampão residual. DNA de elute. Coloque a placa de resina sobre uma placa de recolha de 800 μL limpa. Adicionar 300 μL de solução N5 a cada poço. Deixe-o sentar-se no RT por 10 minutos, a seguir gire as placas empilhadas por 5 minutos em 20 x g com velocidade lenta da rampa-acima. Gire as chapas empilhadas por 1 min a 233 x g. Quantifique o DNA e armazene as placas a-20 ° c até o uso posterior ou prossiga direto para a precipitação do DNA.Nota: é necessário um mínimo de 30 μg de ADN por amostra. Se o rendimento do DNA for baixo, recomenda-se repetir a mini-preparação do DNA ou, alternativamente, combinar duas placas durante o passo de precipitação (secção 2,3). Precipitação do ADN Descongelar placas, Vortex para homogeneizar a solução de DNA, e girar em 230 x g para 30 s para coletar toda a solução no fundo do poço. Adicionar 40 μL de NaOAc de 3 M e 240 μL de isopropanol a cada poço. Cubra a placa com um selo de alumínio e misture invertendo 3x. Centrifugue as placas por 30 min a 3.800 x g e 25 ° c. Elimine cuidadosamente o sobrenadante.Nota: para combinar duas placas, transfira o DNA da segunda placa para o pellet da primeira placa e repita os passos 2.3.2 – 2.3.3. Lave e precipeie o DNA. Adicionar 400 μL de 80% de etanol a cada poço. Placas de vedação com vedação de alumínio e agitar a 1.000 rpm por 30 min. centrifugador a 3.800 x g durante 30 min a 25 ° c. Descarte o sobrenadante. Seque as pelotas de DNA. Coloque as placas de cabeça para baixo em um ângulo em toalhas de papel e deixe-os secar por 1 – 2 h, até que nenhum álcool esteja presente na parte inferior do poço. Sele e Centrifugue em 230 x g por 2 minutos para trazer todas as pelotas para baixo. Uma vez que as placas estão secas, ou vedação com vedação de alumínio e congelar a-20 ° c para uso posterior ou continuar a ressuscitaro o DNA (passo 4,1). 3. revestimento da corrediça de aminosilane Coloc as corrediças de vidro na cremalheira do metal. Inspecione visualmente cada corrediça para assegurar nenhuns riscos ou as imperfeições estão atuais. Submerge slides em solução de revestimento (2% de reagente de de em acetona) durante 15 min durante o balanço. A solução do de pode ser usada para revestir duas cremalheiras de 30 corrediças cada um antes que precise de ser Descartado. Enxaguar a etapa. Mergulhe o rack de slides na lavagem de acetona (99% acetona), agitar para frente e para trás, em seguida, para cima e para baixo rapidamente 5x. Incline para um canto para pingar, em seguida, submergir em água ultrapura para cima e para baixo rapidamente 5x. Incline para pingar fora, em seguida, coloque em guardanapos.Nota: a lavagem de acetona pode ser usada duas vezes, enquanto a água ultrapura deve ser mudada de cada vez. Seque as corrediças usando o ar pressionado, soprando neles de todos os ângulos por aproximadamente 3 minutos até que todas as gotas de água estejam removidas. Armazene os slides revestidos em RT em uma cremalheira de metal dentro de uma caixa firmemente selada. 4. preparação da amostra da matriz Ressuspender o pellet de DNA da mini-Prep em casa (passo 2.3.6) em 20 μL de água ultrapura e agitar a 1.000 rpm por 2 h. Para o DNA de preparação MIDI/Max, diluir cada amostra para uma concentração final de 1,5 μg/μL e transferir 20 μL para uma placa de coleta de 800 μL. Prepare a mistura de impressão. Para 1 96 placa de poço, prepare 1 mL de mistura de impressão [237,5 μL de água ultrapura; 500 μL de poli-lisina (0, 1%); 187,5 μL de BS3 (BIS-sulfosuccinimidyl, 50 mg/mL em DMSO); e 75 μL de anticorpo policlonico de coelho antibandeira)].Nota: os produtos químicos devem ser adicionados na ordem especificada para evitar a precipitação. Adicionar 10 μL de mistura de impressão para cada amostra, placas de vedação com folha de alumínio, e agitar em RT para 90 min em 1.000 rpm. Guarde as placas durante a noite (~ 16 h) a 4 ° c. No dia da impressão, brevemente vórtice e girar as placas. Transfira 28 μL de cada amostra para uma placa de 384 matriz. Esta transferência pode ser feita usando a automatização ou uma pipeta multicanal. É crucial manter o controle da posição das amostras na placa da matriz 384. Gire a placa para baixo brevemente para remover quaisquer bolhas. Selar as placas com folha. 5. geração de matrizes de NAPPA: impressão do microarray Nota: todas as condições de impressão foram otimizadas para o instrumento listado na tabela de equipamentos e materiais. Se estiver usando uma matriz diferente, pode ser necessária uma otimização adicional. Arrayer limpar. Antes de começar, esvazie todos os tanques de resíduos e reabasteça os reservatórios com água ultrapura ou 80% de etanol, se necessário. Limpe os pinos um-por-um com toalhetes sem fiapos e água ultrapura. Seque os pinos com toalhetes sem fiapos e coloque-os cuidadosamente de volta na cabeça do arrayer. Arrayer configurado: especificações de impressão [número máximo de selos por tinta: 1; número de selos por ponto: 1; cronometragem de carimbo:–; tempo de carimbo (MS): 0 ms; tempo de escrita à tinta (MS): 0 ms; ajuste de profundidade de impressão: 90 mícrons; número de retoques: 0]. em seguida, siga as Protocolo de esterilização: lavagem de água ultrapura para 2.000 MS com 0 ms de tempo de secagem e 500 MS de tempo de espera; Repita estes passos 6x; seguido de lavagem com 80% de etanol para 2.000 MS com 1.200 MS de tempo de secagem e 500 MS de tempo de espera; Repita estes passos 6x. Projeto da corrediça: ajuste o arrayer com o teste padrão de arraying desejado. O projeto deve levar em consideração vários fatores [ou seja, o número de réplicas para cada amostra, localização e número de recursos de controle, layout de matriz (um bloco, vários blocos idênticos), número de matrizes a serem impressos, comprimento da execução, etc.]. Coloc os slides revestidos de (etapa 3,4) no deck do arrayer. Verifique se o aspirador está segurando todos os slides firmemente no lugar. Inicie o humidificador (deve ser fixado em 60%). Coloc a placa do poço 384 na plataforma do arrayer. Inicie o programa. Rotule os microarrays. Quando a impressão é feita, coloque rótulos de slides no lado inferior (não impresso) de cada slide. Mantenha a ordem de impressão dos slides no deck em ordem numérica. Armazene as matrizes impressas em RT em uma cremalheira de metal dentro de uma caixa firmemente selada com um pacote de sílica. As corrediças mantidas em um ambiente seco têm uma vida útil até um ano. (Opcional): um segundo lote de 90 slides pode ser impresso usando as mesmas amostras. Para fazer isso, retire a placa 384 bem do deck arrayer assim que a impressão da placa é feita. Sele e guarde a placa a 4 ° c. Após o primeiro lote de matrizes são completamente feitos, removê-los do convés, coloque novos slides revestidos de e iniciar uma nova corrida. Certifique-se de que cada 384 placa de poço está em RT por 30 min antes de seu uso. Se mais de quatro réplicas por amostra forem impressas em um lote de slides, é recomendável dividir as placas de 384 poços em duas placas para diminuir a evaporação da amostra diminuindo a quantidade de tempo gasto no deck do arrayer.Nota: Verifique todos os reservatórios antes do início da segunda execução. 6. detecção de DNA em slides NAPPA Bloqueie os slides. Coloque os slides em uma caixa de pipeta e adicione 30 mL de buffer de bloqueio. Incubar em RT por 1 h em um agitador de balanço. Manchar os slides. Elimine a solução de bloqueio e adicione 20 mL de tampão de bloqueio e 33 μL de corante fluorescente de ADN intercalante. Incubar por 15 min com agitação. Em seguida, enxague rapidamente as lâminas com água ultrapura e seque com ar pressuriado. Prossiga com a digitalização (secção 11). 7. expressão das lâminas NAPPA Bloqueie os slides com buffer de bloqueio em um agitador de balanço na RT por 1 h. Use aproximadamente 30 mL em uma caixa de pipeta para quatro lâminas. Enxague as lâminas com água ultrapura e seque com ar comprimido filtrado. Aplique a junta de vedação a cada slide de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar IVTT Mix. Cada slide exigirá 150 μL de mistura de IVTT. Diluir 82,5 μL de lisado de HeLa em 33 μL de água DEPC e complementar com 16,5 μL de proteínas acessórias e 33 uL de mistura de reacção. Adicione a mistura de IVTT da extremidade non-Label ou da não-amostra. Pipetar a mistura lentamente (é aceitável se ele se Perla temporariamente na extremidade de entrada). Massageie suavemente a junta de vedação para que a mistura IVTT se espalhe e cubra toda a área da matriz. Aplique os selos pequenos da porta redonda a ambas as portas. Coloque os slides em um suporte e transferi-los para a incubadora de refrigeração programável. Incubar por 90 min a 30 ° c para expressão protéica, seguido de 30 min a 15 ° c para imobilização da proteína de consulta. Lave e bloqueie os slides. Retire a junta de vedação e mergulhe as lâminas numa caixa de pipeta com cerca de 30 mL de 1x TBST suplementado com 5% de leite para exposição proteica (secção 8) ou 1x TBST suplementado com 3% de albumina sérica bovina (BSA) para ensaios de quinase ou rastreio de medicamentos (secção 9). Incubar em RT com agitação por 20 min e repita este passo 2x. 8. detecção de proteínas em matrizes NAPPA Adicione o anticorpo preliminar. Remova os slides da solução de bloqueio (etapa 7,5) e seque suavemente o verso (lado não impresso) usando uma toalha de papel. Coloque os slides em um suporte e aplique 600 μL de anticorpo primário (mouse anti-Flag) diluído 1:200 em 1x TBST + 5% de leite. Incubar por 1 h em RT. Lave as lâminas com 1x TBST + 5% de leite em um agitador de balanço (3x por 5 min cada). Adicione o anticorpo secundário. Retire os slides da solução de lavagem e seque suavemente o verso usando a toalha de papel. Coloque os slides em um suporte e aplique 600 μL de anticorpo secundário (anticorpo Cy3-labbeled anti-mouse) diluído 1:200 em 1x TBST + 5% leite. Proteja os slides da luz e incubar por 1 h em RT. Lave as lâminas com 1x TBST em um agitador de balanço (3x por 5 min cada). Enxague rapidamente as lâminas com água ultrapura e seque utilizando ar pressuriado. Prossiga com a digitalização (secção 11). 9. triagem do inibidor da tirosina quinase em matrizes NAPPA Observação: vários slides podem ser processados no mesmo experimento, no entanto, certifique-se de que em cada etapa, um slide é processado por vez e que eles não secam entre as etapas. Adicione todas as soluções à extremidade não-rótulo ou não-espécime do slide. Prepare todas as soluções utilizadas durante a triagem de drogas: Prepare a solução de fosfatase/DNase combinando o seguinte: tampão das metaloffosfatases da proteína 1x (50 milímetros HEPES, 100 milímetros NaCl, 2 milímetros DTT, 0, 1% Brij 35 em pH = 7,5); 1 mM MnCl2; 8.000 unidades de proteína fosfatase lambda; e 2 unidades de DNase I. Prepare 400 μL da solução para cada microarray. Adicionar fosfatase e DNase pouco antes de usar. Faça a diluição da droga. As drogas são reconstituídas em DMSO para uma concentração final de 10 mM. Para garantir que todas as concentrações de fármacos testadas na matriz, assegure-se de que o mesmo volume de DMSO (um estoque de 10.000 x no DMSO) seja criado para cada concentração e mantido em-80 ° c. No momento do uso, as drogas são diluídas 1:100 na água. Prepare a solução da droga/quinase combinando o seguinte: tampão da quinase 1x (Tris-HCl de 25 milímetros do pH = 7,5); Beta-glicerofosfato de 5 mM; 2 mM DTT; 0,1 mM na3vo4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; e 2 μL de fármaco (diluído 1:100 em água). Prepare 200 μL da solução para cada microarray. Realize o tratamento com fosfatase e DNase. Remova os slides da solução de bloqueio (etapa 7,5) e seque suavemente a parte traseira usando a toalha de papel. Coloque as lâminas em suporte e aplique 200 μL de solução de fosfatase/DNase. Coloque uma lamínula de Microarray para evitar a evaporação. Incubar a 30 ° c por 45 min no forno. Fosfatase e tratamento com DNase II: Retire as matrizes do forno, descarte a lamínula, retire o excesso de solução e aplique 200 μL de fosfatase recém-feita e solução de DNase. Cubra Microarrays com lamínula e incubar por mais 45 min a 30 ° c no forno. Lave os slides com 1x TBST + 0,2 M NaCl em um agitador de balanço (3x por 5 min cada). Realize o tratamento medicamentoso e a reação da quinase. Retire os slides da solução de lavagem e seque suavemente a parte traseira usando uma toalha de papel. Coloque as lâminas em suporte e aplique 200 μL de solução de fármaco/quinase. Coloque uma lamínula na parte superior para evitar a evaporação. Incubar por 1 h a 30 ° c no forno. Lave os slides com 1x TBST + 0,2 M NaCl em um agitador de balanço (3x por 5 min cada). Repita as etapas 8.1 – 8.4 usando como anticorpo primário anti-phosho-Tyr anticorpo diluído 1:100. Substitua 1x TBST + 5% leite em todas as etapas com 1x TBST + 3% BSA. 10. protocolo de hibridação automatizado Nota: Alternativamente, uma estação de hibridação pode ser usada para automatizar todas as hibridizações e lavagens nas matrizes NAPPA (seções 7 – 9) e o protocolo é fornecido como arquivo complementar 1. 11. aquisição de imagens Nota: as imagens de Microarray devem ser adquiridas com uma resolução de 20 mícrons ou mais. Carregue Microarrays no compartimento do porta-lâmina com as proteínas voltadas para cima. Carregue a revista no scanner de Microarray. Selecione o laser verde com um filtro de emissão de 575/30 nm para digitalizar o sinal do anticorpo secundário rotulado com CY-3. Se for usado um fluoróforo diferente, selecione o laser/comprimento de onda corretos para detectar o sinal do corante fluorescente. Defina o nome para cada imagem e o local que eles serão salvos. (Opcional): para cada novo fluoróforo, recomenda-se a otimização das condições de digitalização para detectar a amplitude linear da intensidade do sinal. Para fazer isso, digitalizar um microarray usando uma gama de fotomultiplicador (PMT) e ganho até que uma imagem clara é obtida com sinal não saturado e fundo baixo. Analise todos os microarrays com as configurações otimizadas e lembre-se de desativar o autogain.Observação: para análise de dados, todos os microarrays devem ser verificados usando as mesmas configurações de digitalização. Para os ensaios de quinase usando Cy3 como um fluoróforo, as imagens são digitalizadas com 20% de PMT, intensidade de laser de 25% e 10 mícrons de resolução, usando o scanner listado na tabela de equipamentos e materiais. 12. processamento e análise de dados Nota: vários pacotes de software estão disponíveis para a quantificação de dados de Microarray com capacidades semelhantes. O procedimento descrito aqui foi projetado para o software listado na tabela de equipamentos e materiais. Carregue os arquivos TIFF a serem quantificados, projete a grade para corresponder ao layout do Microarray e ajuste o tamanho dos pontos para incorporar todo o sinal com a área mínima possível. Os pontos vizinhos não devem se sobrepor. Inspecione visualmente o quão bem o software está realizando e ajuste a grade manualmente, se necessário. Quantificar a intensidade do sinal do Microarray. Inspecione visualmente os pontos para qualquer anormalidade (ligação não específica, poeira, etc.) e remova-os da análise de dados. Corrija o plano de fundo localmente usando o sinal de áreas vizinhas na matriz em que nenhum ponto está presente. Normalize os dados. Para comparar o sinal entre matrizes diferentes, a intensidade do sinal de cada microarray deve ser normalizada. Para excluir quaisquer outliers, normalizar os dados usando a média aparada 30% do sinal do controle positivo (pontos de IgG) dos Microarrays dephosphorylated.Nota: o sinal do ponto de IgG não muda durante a fosforilação e desfosforilação dos Microarrays e é apropriado para a normalização. Identifique as cinases ativas. Para cada recurso exibido no microarray, calcule a razão entre a intensidade do sinal normalizado nas matrizes autofosforiladas e dephosphorylated. Definir um limiar de 1,5-dobre a mudança para a identificação das cinases ativas e marcar todas as outras características como incapaz de submeter-se a autofosforilação (N/A). Calcule a atividade de cada quinase identificada na etapa 12,5 como uma porcentagem do sinal ajustado (intensidade do sinal da matriz de controle positivo normalizado (DMSO) subtraída pela intensidade do sinal da matriz de controle negativo normalizado (dephosphorylated).