자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

1. 일반적인 버퍼 및 솔루션 사용 결핵 매체를 준비: 훌륭한 국물 (24 g/L 효모 추출 물; 20 g/L 트립톤; 4 mL/L 글리세롤; 0.017 M KH2PO4;그리고 0.072 M K2HPO4). 0.017 M KH2PO4 및 0.072 M K2HPO4 솔루션은 10x 인산완충충(0.17 M KH2PO4 및 0.72 MK2HPO4)으로구매할 수 있다. LB 배지 준비: 루리아-베르타니 (5 g/L 효모 추출물; 10 g/L 트립톤; 10 g/L NaCl). 5 M NaOH로 pH를 7.0으로 조정합니다. 1x TBS 준비: 트리스 버퍼링 식염수 (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH = 7.5; 150 mM NaCl). 1x TBST 준비: 0.1% 트웬 20으로 보충된 TBS. 2. DNA 준비 참고 : NAPPA 어레이에 사용되는 DNA는 매우 순수해야합니다. 따라서 상업용 DNA 미니 프렙은 권장되지 않습니다. 현재, DNA 준비를 위한 2개의 프로토콜이 이용됩니다: 집에서 높은 처리량 미니 준비 (여기에 기술된) 또는 상업적인 Midi- 또는 Maxi 준비. 사내 미니 준비 프로토콜의 평균 처리량은 1인당 하루 1,500개의 샘플입니다. 사내 고처리량 미니 준비를 위한 세균 성장 LB /한천 옴니 플레이트를 준비합니다. LB 한천 30-40 mL을 부어 (LB 미디어에 1.5 % 양성 클론 선택을위한 항생제로 보충 된 세균 한 천) 각 단일 웰 플레이트에. LB/한천 플레이트에 글리세롤 스톡을 발견하십시오. LB 매체에 글리세롤 스톡을 희석하십시오 (1 :300, 보통 2 μL에서 600 μL의 LB). 10 분 동안 흔들어. 희석 된 스톡의 3 μL을 LB / 한천 접시에 놓습니다. 37 °C에서 배양, 거꾸로, 하룻밤. 문화를 접종합니다. 80% 에탄올 및 화염으로 멸균된 96핀 장치를 사용하여, 항생제로 보충된 결핵 배지의 웰당 1.5 mL로 한천판에서 배양을 접종하였다. 배양 배양. 가스 투과성 씰로 블록을 덮고 셰이커에 따라 37 °C, 300-800 rpm에서 22-24 시간 동안 배양하십시오.참고: 800rpm으로 설정된 셰이커는 이 배양에 최적입니다. 느린 속도 셰이커를 사용하면 조밀한 배양이 줄어들고 DNA 정화 수율이 낮아질 수 있습니다. 펠릿 문화. 3,800 x g및 4 °C에서 30 분 동안 블록을 스핀하십시오. 사내 고처리량 미니 준비참고: 멀티 채널 파이펫터 또는 자동 디스펜서를 사용하여 사내 고처리량 미니 프렙을 수행할 수 있습니다. 자동 디스펜서를 사용하는 경우 사용하기 전에 그리고 솔루션 사이에 시스템을 청소해야 합니다.미니 준비 중에 사용되는 모든 솔루션을 준비합니다. 솔루션 준비 1: TE 재서스펜션 버퍼(50 mM Tris, pH = 8.0; 10 mM EDTA, pH = 8.0; 0.1 mg/mL RNAe). 4 °C에서 보관하십시오. 솔루션 준비 2: NaOH/SDS 용해 버퍼(0.2 M NaOH; 1% SDS). 더 나은 결과를 얻으려면 갓 만든 솔루션을 사용해야합니다. 솔루션 준비 3: KOAC 중화 버퍼(2.8M KOAc). 빙하 아세트산으로 용액의 pH를 5.1로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 솔루션 N2 준비: 평형 버퍼 (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0.15% 트리톤 X-100). 인산으로 용액의 pH를 6.3으로 조정합니다. 솔루션 N3 준비: 배쉬 버퍼 (100 mM Tris; 1.15 M KCl; 15% EtOH). 인산으로 용액의 pH를 6.3으로 조정합니다. 용액 N5 준비: 용출 버퍼 (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). 인산으로 용액의 pH를 8.5로 조정합니다.참고: 음이온 교환 동안 DNA 결합, 세척 및 용출의 성공적인 제어는 완충된 KCl 농도 및 pH 값에 크게 의존한다. 신중한 버퍼 부품 측정 및 pH 조정이 필수적입니다. 설명된 측정값의 작은 편차는 수율의 상당한 손실을 초래할 수 있습니다. 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 용액 1의 200 μL을 추가하고 RT에서 5 분 동안 2,000 rpm에서 흔들어 주세요. 성공적인 용해를 위해 펠릿의 완전한 재 현탁액이 필요합니다. 필요한 경우 블록을 소용돌이. 박테리아를 lyse. 용액 2의 200 μL을 추가하고 알루미늄 씰로 플레이트를 밀봉하고 5 x를 반전하십시오. 신중하게 솔루션 2 추가의 시작 부분에서이 단계를 시간. 5분을 초과하지 마십시오. 솔루션을 중화합니다. 용액 3의 200 μL을 추가하고 알루미늄 씰로 플레이트를 밀봉하고 5 x를 반전하십시오. 물개는 용해/중화 버퍼로 인해 느슨할 수 있으므로 반전할 때는 주의하십시오. 용액이 씰에 닿지 않는 부분 반전은 시료 간의 교차 오염을 방지하는 것이 좋습니다. 명확한 리세이트. 3,800 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 용해 펠릿 원심 분리 단계 동안 용해 교환 수지 슬러리를 준비합니다. 1L 병을 사용하여 음이온 교환 수지로 300 mL 마크에 도달 할 때까지 채운 다음 용액 N2를 최대 900 mL까지 추가하십시오.주의 : 이 단계는 실리카 흡입으로부터 보호하기 위해 후드에서 수행해야합니다. 아니온 교환 수지 플레이트를 준비합니다. 폐기물 수거 용기역할을 하기 위해 깊은 우물 블록 위에 필터 플레이트를 쌓습니다. 음이온 교환 슬러리가 균일 할 때까지 혼합 한 다음 유리 트로프에 부어 넣습니다. 넓은 지루한 P1000 팁을 사용하여 슬러리의 450 μL을 필터 플레이트의 각 우물에 전달합니다. 원심 분리기 는 130 x g 및 RT에서 5 분 동안 느린 가속으로 플레이트 (수지 플레이트 / 깊은 우물 플레이트)를 쌓아 놓습니다. 수지 플레이트 / 깊은 우물 블록 스택에 리세이트 상판을 전송합니다. 느린 램프 업 속도로 30 x g에서 5 분 동안 적층 된 플레이트를 회전시킵니다. 열을 씻으시고. 400 μL의 용액 N3(세척 버퍼)을 각 웰에 추가합니다. 수지 플레이트를 진공 매니폴드로 이송하여 세척 버퍼를 제거합니다. 세탁 단계를 3x 반복합니다. 마지막 세척시, 모든 우물이 제대로 비워졌는지 확인하십시오. 스택 플레이트를 150 x g에서 5분 동안 회전하여 잔류 버퍼를 제거합니다. DNA를 용해. 수지 플레이트를 깨끗한 800 μL 컬렉션 플레이트에 놓습니다. 각 우물에 300 μL의 용액 N5를 추가합니다. RT에 10 분 동안 앉은 다음 느린 램프 업 속도로 20 x g에서 5 분 동안 쌓인 플레이트를 회전시킵니다. 233 x g에서1 분 동안 적층 된 접시를 돌이되다. DNA를 정량화하고 플레이트를 -20°C에서 저장하여 추가 사용하거나 DNA 침전으로 바로 진행합니다.참고: 샘플당 최소 30 μg의 DNA가 필요합니다. DNA 수율이 낮은 경우, DNA 미니 프렙을 반복하거나, 또는 침전 단계(섹션 2.3) 동안 두 판을 조합하는 것이 좋습니다. DNA 침전 플레이트를 해동하고, DNA 용액을 균질화하기 위해 소용돌이를 만들고, 우물 바닥에 있는 모든 용액을 수집하기 위해 30s동안 230 x g에서 회전한다. 각 우물에 40 μL의 3 M NaOAc 및 240 μL의 이소프로판올을 추가합니다. 알루미늄 씰로 접시를 덮고 3x를 뒤집어 섞습니다. 3,800 x g 및 25 °C에서 30 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 조심스럽게 상급을 폐기하십시오.참고 : 두 판을 결합하려면 두 번째 플레이트에서 DNA를 첫 번째 플레이트에서 펠릿으로 옮기고 2.3.2-2.3.3 단계를 반복합니다. DNA를 씻고 침전시. 각 우물에 80% 에탄올의 400 μL을 추가하십시오. 알루미늄 씰로 접시를 밀봉하고 30 분 동안 1,000rpm에서 흔들어 줍니다. 25 °C에서 30 분 동안 3,800 x g에서 원심 분리기. 상급제는 버리십시오. DNA 펠릿을 건조시. 접시를 종이 타월에 비스듬히 거꾸로 놓고 우물 바닥에 알코올이 없을 때까지 1-2 시간 동안 건조시키십시오. 230 x g에서 2 분 동안 밀봉 및 원심 분리기를 사용하여 펠릿을 내려 오십시오. 플레이트가 건조되면 알루미늄 씰로 밀봉하고 나중에 사용하기 위해 -20 °C에서 얼리거나 DNA를 계속 일시 중단하십시오 (4.1 단계). 3. 아미노일란 슬라이드 코팅 유리 슬라이드를 금속 랙에 놓습니다. 각 슬라이드를 시각적으로 검사하여 긁힘이나 결함이 없는지 확인합니다. 흔들면서 15 분 동안 코팅 용액 (아세톤에 2 % 아미노 슬레인 시약)에 잠긴 슬라이드. 아미노일란 용액은 폐기되기 전에 각각 30개의 슬라이드 두 랙을 코팅하는 데 사용할 수 있습니다. 헹위 합니다. 슬라이드 랙을 아세톤 워시(99% 아세톤)에 담그고 앞뒤로 흔들어 서 빠르게 5배 위아래로 움직입니다. 한 쪽 모서리로 기울여 물방울을 떨어뜨린 다음 울트라퓨어 워터에 빠르게 5배 빠르게 담급전히 담급합니다. 기울어서 떨어뜨립니다.참고: 아세톤 워시는 두 번 사용할 수 있으며, 초순수는 매번 교체해야 합니다. 모든 물방울이 제거 될 때까지 약 3 분 동안 모든 각도에서 불어, 압력 공기를 사용하여 건조 슬라이드. 코팅된 슬라이드를 RT에 단단히 밀봉된 상자 안에 금속 랙에 보관하십시오. 4. 배열 샘플 준비 20 μL의 초순수에서 사내 미니 프렙(단계 2.3.6)에서 DNA 펠릿을 다시 일시 중단하고 2시간 동안 1,000 rpm에서 흔들어 줍니다. midi/max 준비 DNA의 경우 각 샘플을 1.5 μg/μL의 최종 농도로 희석하고 20 μL을 800 μL 수집 플레이트로 옮긴다. 인쇄 믹스를 준비합니다. 96개의 웰 플레이트에 대해 인쇄 믹스 1mL[초순수 237.5 μL, 폴리리신 500 μL(0.01%); BS3 의 187.5 μL(비스-설포수니미딜, DMSO에서 50 mg/mL)과 75 μL의 폴리클로날 항항항을 준비합니다.참고 : 화학 물질은 강수량을 피하기 위해 지정된 순서로 추가해야합니다. 각 샘플에 10 μL의 인쇄 믹스를 추가하고 알루미늄 호일로 접시를 밀봉하고 RT에서 1,000 rpm에서 90 분 동안 흔들어줍니다. 플레이트를 4°C에서 밤새(~16시간) 보관합니다. 인쇄 일에, 잠시 소용돌이와 접시를 회전. 각 샘플의 28 μL을 384 어레이 플레이트로 이송합니다. 이 전송은 자동화 또는 다중 채널 파이펫을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 384 어레이 플레이트에서 샘플의 위치를 추적하는 것이 중요합니다. 접시를 잠시 아래로 돌리면 거품이 제거됩니다. 호일로 접시를 밀봉하십시오. 5. NAPPA 어레이 생성 : 마이크로 어레이 인쇄 참고: 모든 인쇄 조건은 장비 및 재료 표에나열된 기기에 최적화되었습니다. 다른 배열을 사용하는 경우 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 배열기 정리. 시작하기 전에 모든 폐기물 탱크를 비우고 필요한 경우 초순수 또는 80 % 에탄올로 저수지를 리필하십시오. 보풀이 없는 물티슈와 초순수로 핀을 하나씩 청소합니다. 보풀이 없는 물티슈로 핀을 말려서 어레이헤드에 조심스럽게 넣습니다. 배열자 설정: 인쇄 사양 [잉크당 최대 스탬프 수: 1; 스팟당 스탬프 수: 1; 멀티 스탬프 타이밍: –; 스탬프 시간(ms): 0 ms; 수동 입력 시간(ms): 0 ms: 0 ms; 인쇄 깊이 조정: 90 미크론; 터치 오프 수: 0]. 살균 프로토콜 : 건조 시간 0 ms와 대기 시간 500 ms와 2,000 ms에 대한 초순수 물 세척; 이 단계를 6x 반복합니다. 건조 시간 1,200 ms와 대기 시간의 500 ms와 2,000 ms에 대한 80 % 에탄올세척 다음; 이 단계를 6x 반복합니다. 슬라이드 디자인: 원하는 배열 패턴으로 어레이거를 설정합니다. 디자인은 여러 가지 요소 (즉, 각 샘플에 대한 복제본 수, 위치 및 컨트롤 기능 수, 배열 레이아웃 (한 블록, 여러 개의 동일한 블록), 인쇄 할 배열 수, 실행 길이 등)을 고려해야합니다. 아미노일레인 코팅 슬라이드(단계 3.4)를 어레이 데크에 놓습니다. 진공이 모든 슬라이드를 제자리에 단단히 고정하고 있는지 확인합니다. 가습기를 시작합니다 (60 %로 설정해야합니다) 배열 갑판에 384 웰 플레이트를 놓습니다. 프로그램을 시작합니다. 마이크로어레이에 레이블을 지정합니다. 인쇄가 완료되면 각 슬라이드의 아래쪽(인쇄되지 않은) 쪽에 슬라이드 레이블을 놓습니다. 데크에서 슬라이드 인쇄 순서를 숫자 순서로 유지합니다. 인쇄된 어레이를 RT에 실리카 패킷이 있는 단단히 밀봉된 상자 안에 금속 랙에 보관하십시오. 건조한 환경에서 보관된 슬라이드의 유효 기간은 최대 1년까지입니다. (선택 사항): 동일한 샘플을 사용하여 90개의 슬라이드의 두 번째 배치를 인쇄할 수 있습니다. 이렇게 하려면 플레이트 인쇄가 완료되는 즉시 어레이 데크에서 384 웰 플레이트를 제거합니다. 접시를 4 °C에서 밀봉하고 보관하십시오. 배열의 첫 번째 배치가 완전히 완료 된 후, 갑판에서 그들을 제거, 새로운 아미노 일레인 코팅 슬라이드를 배치하고 새로운 실행을 시작합니다. 각 384 웰 플레이트는 사용 전에 30 분 동안 RT에 있는지 확인하십시오. 샘플당 4개 이상의 복제본이 슬라이드 배치로 인쇄되는 경우 384개의 웰 플레이트를 두 개의 플레이트로 분할하여 어레이 데크에 소요되는 시간을 줄여 샘플 증발을 줄이는 것이 좋습니다.참고: 두 번째 실행이 시작되기 전에 모든 저장소를 확인합니다. 6. NAPPA 슬라이드에 DNA의 검출 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 파이펫 상자에 넣고 블로킹 버퍼 30mL를 추가합니다. 흔들쉐이커에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 슬라이드에 얼룩을 지십시오. 차단 용액을 버리고 20 mL의 차단 버퍼와 형광 DNA 간질 염료 33 μL을 추가합니다. 교반으로 15 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 초순수로 슬라이드를 빠르게 헹구고 압력 공기로 건조시십시오. 스캔을 진행합니다(섹션 11). 7. NAPPA 슬라이드의 표현 RT의 흔들 쉐이커에서 블로킹 버퍼로 슬라이드를 1시간 동안 차단합니다. 초순수로 슬라이드를 헹구고 여과된 압축 공기로 건조시면 됩니다. 제조업체의 지침에 따라 각 슬라이드에 밀봉 개스킷을 적용합니다. IVTT 믹스를 추가합니다. 각 슬라이드에는 150 μL의 IVTT 혼합물이 필요합니다. DEPC 물 33 μL에서 82.5 μL의 HeLa 용해물을 희석하고 16.5 μL의 액세서리 단백질과 33 uL의 반응 혼합물로 보충하십시오. 비 라벨 또는 비 시편 끝에서 IVTT 혼합물을 추가합니다. 천천히 믹스를 파이펫 (그것은 입구 끝에서 일시적으로 구슬 경우 허용). IVTT 혼합물이 퍼지고 어레이의 전체 영역을 덮을 수 있도록 밀봉 개스킷을 부드럽게 마사지하십시오. 두 포트모두에 작은 원형 포트 씰을 적용합니다. 슬라이드를 지지대위에 놓고 프로그래밍 가능한 냉각 인큐베이터로 옮김을 옮김으로 옮김을 배치합니다. 단백질 발현을 위해 30°C에서 90분 동안 배양한 다음, 질의 단백질의 고정화를 위해 15°C에서 30분씩 배양하였다. 슬라이드를 씻고 차단합니다. 밀봉 개스킷을 제거하고 단백질 디스플레이를 위해 5% 우유로 보충된 1x TBST의 약 30 mL로 파이펫 상자에 슬라이드를 담그거나(섹션 8) 또는 키나아제 검사 또는 약물 스크리닝을 위해 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 보충된 1x TBST를 보충하였다. RT에서 20 분 동안 교반하여 배양하고이 단계를 2x 반복하십시오. 8. NAPPA 어레이에서 단백질 검출 1 차 적인 항체를 추가합니다. 차단 용액에서 슬라이드를 제거하고(7.5단계) 종이 타월을 사용하여 뒷면(인쇄되지 않은 면)을 부드럽게 건조시고 있습니다. 슬라이드를 지지체위에 놓고 1x TBST + 5% 우유에 1:200희석된 1차 항체(마우스 항플래그)의 600 μL을 적용한다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 흔들쉐이커에 1x TBST + 5% 우유로 슬라이드를 씻으십시오(각 5분당 3x). 이차 항체를 추가합니다. 세탁용액에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 뒷면을 부드럽게 건조시면 됩니다. 슬라이드를 지지체위에 놓고 1x TBST + 5% 우유에 1:200을 희석한 이차 항체(cy3-labbeled 항마우스 항체)의 600 μL을 적용합니다. 빛으로부터 슬라이드를 보호하고 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 흔들쉐이커에서 1x TBST로 슬라이드를 세척합니다(각 5분당 3x). 초순수로 슬라이드를 빠르게 헹구고 압력 공기를 사용하여 건조시십시오. 스캔을 진행합니다(섹션 11). 9. NAPPA 어레이에 티로신 키나아제 억제제 스크리닝 참고: 동일한 실험에서 여러 슬라이드를 처리할 수 있지만 각 단계에서 한 번에 하나의 슬라이드가 처리되고 단계 간에 건조되지 않도록 해야 합니다. 슬라이드의 비레이블 또는 비시편한 끝에 모든 솔루션을 추가합니다. 약물 스크리닝 중에 사용되는 모든 솔루션을 준비하십시오. 다음을 결합하여 인산염/DNase 용액을 준비한다: 1x 단백질 메탈로-인산염 완충제(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.01% Brij 35 에서 pH=7.5); 1 mM MnCl2; 람다 단백질 인산염의 8,000 단위; 및 DNase I. 각 마이크로어레이에 대해 용액의 400 μL을 준비한다. 사용하기 직전에 인산염과 DNase를 추가하십시오. 약물 희석을 하십시오. 약물은 10 mM의 최종 농도로 DMSO에서 재구성된다. 어레이에서 테스트된 모든 약물 농도를 보장하기 위해, 동일한 부피의 DMSO(DMSO의 10,000x 스톡)가 각 농도에 대해 생성되고 -80°C로 유지되도록 한다. 사용 시, 약물은 물에 1:100 희석됩니다. 다음을 결합하여 약물/키나아제 용액을 준비한다: 1x 키나아제 완충제(pH=7.5의 25 mM Tris-HCl); 5 mM 베타-글리세로인산염; 2 mM DTT; 0.1 mM Na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; 그리고 2 μL의 약물 (물에 희석 1 :100). 각 마이크로어레이에 대해 용액의 200 μL을 준비합니다. 인산염 및 DNase 치료를 수행합니다. 차단 용액에서 슬라이드를 제거하고(7.5단계) 종이 타월을 사용하여 뒷면을 부드럽게 말립니다. 슬라이드를 지지대위에 놓고 200 μL의 인산염/DNase 용액을 적용합니다. 증발을 방지하기 위해 마이크로어레이 커버슬립을 놓습니다. 오븐에서 45 분 동안 30 °C에서 배양하십시오. 인산염 및 DNase 처리 II: 오븐에서 어레이를 제거하고, 커버슬립을 버리고, 과잉 용액을 제거하고, 갓 만든 인산염 및 DNase 용액 200 μL을 적용합니다. 커버 슬립으로 마이크로어레이를 덮고 오븐에서 30°C에서 45분 간 배양합니다. 흔들쉐이커에 1x TBST + 0.2 M NaCl로 슬라이드를 세척하십시오(각 5분당 3x). 약물 치료 및 키나아제 반응을 수행한다. 세탁용액에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 뒷면을 부드럽게 말립니다. 슬라이드를 지지대위에 놓고 200 μL의 약물/키나아제 용액을 적용합니다. 증발을 피하기 위해 덮개 슬립을 위에 놓습니다. 오븐에서 30 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 흔들쉐이커에 1x TBST + 0.2 M NaCl로 슬라이드를 세척하십시오(각 5분당 3x). 1차 항체인 포쇼-티르 항체를 사용하여 8.1-8.4단계를 반복하여 1:100을 희석한다. 모든 단계에서 1x TBST + 5% 우유를 1x TBST + 3% BSA로 교체하십시오. 10. 자동화된 하이브리드화 프로토콜 참고: 또는 하이브리드화 스테이션을 사용하여 NAPPA 어레이(섹션 7-9)의 모든 하이브리드화 및 세차기를 자동화할 수 있으며 프로토콜은 보충 파일 1로제공됩니다. 11. 이미지 획득 참고: 마이크로어레이 이미지는 20미크론 이상의 해상도로 획득해야 합니다. 마이크로어레이를 슬라이드 홀더 매거진에 넣고 단백질을 위로 향합니다. 매거진을 마이크로어레이 스캐너에 로드합니다. 575/30 nm 방출 필터가 있는 녹색 레이저를 선택하여 cy-3 라벨이 부착된 이차 항체에서 신호를 스캔합니다. 다른 형광섬유를 사용하는 경우 올바른 레이저/파장을 선택하여 형광 염료의 신호를 감지합니다. 각 이미지의 이름과 저장할 위치를 정의합니다. (선택 사항): 각각의 새로운 형광에 대해 스캐닝 조건의 최적화를 통해 신호 강도의 선형 범위를 감지하는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 다양한 광증선(PMT)을 사용하여 마이크로어레이를 스캔하고 채도가 낮은 신호와 낮은 배경으로 선명한 이미지를 얻을 때까지 이득합니다. 최적화된 설정으로 모든 마이크로어레이를 스캔하고 자동 게인을 끄는 것을 기억하십시오.참고: 데이터 분석을 위해 모든 마이크로어레이는 동일한 스캔 설정을 사용하여 스캔해야 합니다. cy3를 형광포로 사용하는 키나아제 검소의 경우, 장비 및 재료 표에 나열된 스캐너를 사용하여 20% PMT, 레이저 강도 25%, 해상도 10미크론으로 이미지를 스캔합니다. 12. 데이터 처리 및 분석 참고: 유사한 기능을 가진 마이크로어레이 데이터의 정량화를 위해 여러 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 장비 및 재료 표에나열된 소프트웨어를 위해 설계되었습니다. 정량화할 TIFF 파일을 로드하고, 마이크로어레이 레이아웃과 일치하도록 그리드를 설계하고, 스팟의 크기를 조정하여 전체 신호를 가능한 최소 영역으로 통합합니다. 인접한 지점이 겹치지 않아야 합니다. 소프트웨어가 얼마나 잘 수행되고 있는지 시각적으로 검사하고 필요한 경우 수동으로 그리드를 조정합니다. 마이크로어레이의 신호 강도를 정량화합니다. 비정상(비특이적 바인딩, 먼지 등)이 있는지 를 육안으로 검사하고 데이터 분석에서 제거합니다. 자리가 없는 배열에서 인접 영역의 신호를 사용하여 배경을 로컬로 수정합니다. 데이터를 정규화합니다. 서로 다른 어레이에서 신호를 비교하려면 각 마이크로어레이의 신호 강도를 정규화해야 합니다. 이상값을 제외하려면, 탈인된 마이크로어레이의 양성 대조군(IgG spots)으로부터 신호의 평균 30%를 트리밍하여 데이터를 정규화한다.참고: IgG 스팟의 신호는 마이크로어레이의 인산화 및 탈인 동안 변경되지 않으며 정규화에 적합합니다. 활성 키나아제 식별. 마이크로어레이에 표시되는 각 피쳐에 대해 자동 인포스포릴레이션 어레이와 탈인화물 배열의 정규화된 신호 강도 사이의 비율을 계산합니다. 활성 키나아제 식별을 위해 임계값을 1.5배 변경하여 설정하고 다른 모든 피처를 자동 인산화(N/A)를 수행할 수 없음으로 표시합니다. 12.5단계에서 확인된 각 키나아제의 활성을 조정된 신호의 백분율로 계산한다(정규화된 포지티브 어레이(DMSO)의 신호 세기는 정규화된 음극 대조군 어레이(dephosphorylated)의 신호 강도에 의해 감산된다.