Ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von selbstzusammengesetzten menschlichen Proteinmikroarrays zum Screening von Kinase-Inhibitoren wird vorgestellt.
Das Screening von Kinase-Inhibitoren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Eigenschaften eines Arzneimittels und für die Identifizierung potenziell neuer Ziele mit klinischen Implikationen. Es wurden mehrere Methoden berichtet, um ein solches Screening durchzuführen. Jeder hat jedoch seine eigenen Grenzen (z. B. das Screening nur von ATP-Analoga, die Beschränkung auf die Verwendung von gereinigten Kinase-Domänen, erhebliche Kosten im Zusammenhang mit der Prüfung von mehr als ein paar Kinasen gleichzeitig und mangelnde Flexibilität bei der neuartigen Mutationen). Hier wird ein neues Protokoll vorgestellt, das einige dieser Einschränkungen überwindet und für das unvoreingenommene Screening von Kinase-Inhibitoren verwendet werden kann. Eine Stärke dieser Methode ist ihre Fähigkeit, die Aktivität von Kinase-Inhibitoren über mehrere Proteine hinweg zu vergleichen, entweder zwischen verschiedenen Kinasen oder verschiedenen Varianten derselben Kinase. Es werden selbst zusammengesetzte Proteinmikroarrays eingesetzt, die durch die Expression von Proteinkiinasen durch ein humanbasiertes In-vitro-Transkriptions- und -translationssystem (IVTT) erzeugt werden. Die auf dem Mikroarray angezeigten Proteine sind aktiv, was die Messung der Wirkung von Kinase-Inhibitoren ermöglicht. Im folgenden Verfahren werden die Protokollschritte im Detail beschrieben, von der Mikroarraygenerierung und dem Screening bis zur Datenanalyse.
Proteinkiinasen sind für die Phosphorylierung ihrer Targets verantwortlich und können komplexe molekulare Bahnen modulieren, die viele zelluläre Funktionen steuern (d. h. Zellproliferation, Differenzierung, Zelltod und Überleben). Die Deregulierung der Kinase-Aktivität ist mit mehr als 400 Krankheiten verbunden, was Kinase-Hemmer zu einer der wichtigsten Klassen von Medikamenten macht, die für die Behandlung mehrerer Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf- und neurologischen Erkrankungen sowie entzündlicher und Autoimmunerkrankungen1,2,3.
Mit dem Aufkommen der Präzisionsmedizin hat die Identifizierung neuer Therapien, insbesondere Kinase-Inhibitoren, eine große pharmazeutische und klinische Anziehungskraft. Mehrere Ansätze können für die Identifizierung möglicher neuer Paarvon Kinase/Kinase-Inhibitoren verwendet werden, einschließlich der De-Novo-Konstruktion von Kinase-Inhibitoren und der Identifizierung neuer Ziele für bestehende FDA-zugelassene Medikamente. Letzteres ist besonders attraktiv, da der Zeit- und Geldaufwand für die Umsetzung dieser Medikamente in Kliniken aufgrund der Verfügbarkeit früherer klinischer Studiendaten drastisch reduziert wird. Ein kanonisches Beispiel für die Umnutzung eines Kinase-Inhibitors ist Imatinib, das ursprünglich für die Behandlung chronischer myelogenöser Leukämie (CML) durch die Hemmung von BCR-Abl entwickelt wurde, das auch erfolgreich zur Behandlung von c-Kit-Überexsedern eingesetzt werden kann. gastrointestinale Stromaltumoren (GISTs)4,5,6,7.
Das Screening von Kinase-Inhibitoren kann in bindungsbezogenen Assays oder enzymatischen Assays durchgeführt werden. Die erste Klasse von Assays konzentriert sich auf Protein-Arzneimittel-Wechselwirkungen und kann Informationen wie Ligation Sitte und Affinität liefern. Da die Aktivität der Kinase zum Zeitpunkt dieser Tests unbekannt ist, kann eine Reihe von Wechselwirkungen aufgrund von konformen Veränderungen im Protein übersehen oder fälschlicherweise identifiziert werden. Auf der anderen Seite erfordern enzymatische Assays, dass die Proteinkiinasen aktiv sind und wertvolle Informationen über die Wirkung des Inhibitors auf die Enzymaktivität liefern, aber diese Art des Screenings ist in der Regel zeitaufwändiger und teurer. Derzeit sind beide Arten von Assays kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich. Sie stellen eine zuverlässige Option für das Screening von Kinase-Inhibitoren mit einigen Einschränkungen dar, darunter: I) die meisten Methoden beinhalten das Testen mehrerer Kiinasen einzeln, was das Screening einer großen Gruppe von Proteinen kostspielig machen kann; II) Der zu prüfende Satz von Kiinasen beschränkt sich auf eine Liste vorgewählter, wildartgebundener Kinäasen und mehrerer bekannter mutierter Versionen einiger Kiinasen, was die Prüfung vieler neuer mutierter Isoformen verhindert.
In diesem Zusammenhang sind Protein-Mikroarrays eine leistungsstarke Plattform, die in der Lage ist, einige der Einschränkungen zu überwinden, die durch kommerziell verfügbare Techniken dargestellt werden. Es eignet sich für enzymatische Assays im Hochdurchsatz-Screening mit in voller Länge, aktiven Proteinen jeder Sequenz von Interesse. Die Mikroarrays können durch einen selbstzusammengesetzten Ansatz wie NAPPA (Nukleinsäure programmierbares Proteinarray) erzeugt werden, bei dem Proteine gerade rechtzeitig für die Assays exprimiert werden, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die auf dem Array angezeigten Proteine tatsächlich aktiv sind. Die auf NAPPA angezeigten Proteine werden mit humanabgeleiteten Ribosomen und Chaperonproteinen hergestellt, um die Wahrscheinlichkeit natürlicher Faltung und Aktivität zu verbessern.
Die Proteine werden zunächst programmiert, indem cDNAs, die für Gene von Interesse kodiert werden, die mit einem Capture-Tag zusammen mit einem Erfassungsmittel verschmolzen werden, auf die Mikroarray-Oberfläche gedruckt werden. Die Proteine werden dann auf den Mikroarrays mit einem In-vitro-Transkriptions- und -übersetzungssystem (IVTT) produziert, und die frisch exprimierten Proteine werden durch das Erfassungsmittel auf der Mikroarray-Oberfläche immobilisiert. Ausgedrückte NAPPA-Arrays können für die Untersuchung der auf dem Array angezeigten Proteine in einer unvoreingenommenen, hochdurchsatzigen Art und Weise8,9verwendet werden.
Zuvor wurde gezeigt, dass Proteine, die auf NAPPA-Arrays angezeigt werden, richtig gefaltet werden, um mit bekannten Partnern zu interagieren10; Darüber hinaus wurde ihre enzymatische Aktivität erstmals im Jahr 2018 genutzt, als gezeigt wurde, dass Proteinkiinasen auf dem Mikroarray-Autophosphorylat11angezeigt wurden. Bis heute wurde die NAPPA-Methodik für viele verschiedene Anwendungen verwendet, einschließlich der Biomarker-Entdeckung12,13,14,15,16,17, Protein-Protein-Wechselwirkungen10,18, Substrat-Identifikation19und Arzneimittel-Screening11. Seine Flexibilität ist eines der wichtigsten Merkmale der Plattform, die eine Anpassung an jede Anwendung ermöglicht.
Hier wird ein Protokoll zum Screening von Tyrosinkinase-Inhibitoren in selbst zusammengesetzten NAPPA-Arrays vorgestellt. Die Plattform ist für die Anzeige aktiver menschlicher Proteinkinasen und für die Analyse der Proteinkinase-Aktivität mit niedrigem Hintergrund und hohem Dynamikbereich optimiert. Zu den Änderungen, die zur Verwendung von NAPPA für das Screening von Kinase-Inhibitoren implementiert wurden, gehören: I) Veränderungen in der Druckchemie, II) Dephosphorylierung des Proteinmikroarrays vor dem Kinase-Inhibitor-Screening und III) Optimierung des Nachweises von phosphorylierte Proteine auf dem Array. Dieses Protokoll ist das erste seiner Art und liefert einzigartige Informationen über die Kinase-Studie in NAPPA-Mikroarrays.
Änderungen und Fehlerbehebung
Während der Optimierungsphase der Untersuchung der Kinase-Aktivität auf NAPPA-Arrays war eine der Hauptquellen für Hintergrund und schwacher Dynamikbereich die BSA, die auf dem Druckmix verwendet wurde. BSA lieferte die primären Adern, die für die Vernetzung mit der Aminosilanoberfläche notwendig sind, und die DNA und den Capture-Antikörper an Ort und Stelle ein. BSA ist jedoch stark phosphoryliert, was die Erkennung des Autophosphorylierungssignals auf dem Array über dem Hintergrundrauschen erschwert. Um dieses Problem zu lösen, wurden mehrere Alternativen für BSA im Druckmix getestet, und Polylysin wurde als guter Ersatz identifiziert. Polylysin fehlt jede Phosphorylierung Seisplatz; Daher ist der Hintergrund von nicht ausgedrückten Arrays sehr minimal. Darüber hinaus sind Mikroarrays, die mit Polylysin bedruckt sind, reproduzierbar und weisen gute Proteine auf (Abbildung 2).
Die nächste kritische Änderung, die am Standard-NAPPA-Test durchgeführt wurde, war die Zugabe eines Phosphatase/DNase-Behandlungsschritts. Die Behandlung der Mikroarrays mit Phosphatase ermöglicht die Entfernung jeglicher Phosphorylierung, die im IVTT-Mix während der Proteinsynthese und -erfassung aufgetreten ist (Abbildung 3). Die Quelle dieser Phosphorylierung könnte aus der intrinsischen Autophosphorylierungsaktivität oder aus der Aktivität von Kiinasen stammen, die im IVTT-Mix vorhanden sind. Die Entfernung aller Phosphorylierung nach der Expression ermöglichte eine einfache Identifizierung der Kiinasen, die aktiv sind und einer Autophosphorylierung unterzogen werden können (Abbildung 3).
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
NAPPA ist eine robuste Technologie, aber wie erwartet gibt es mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Erwerb hochwertiger DNA in der entsprechenden Konzentration. Die Verwendung von DNA von schlechter Qualität oder in niedrigen Konzentrationen erzeugt Mikroarrays von schlechter Qualität, wobei mehrere Merkmale nicht ausgedrückt und in den entsprechenden Ebenen angezeigt werden, wodurch die Anzahl der auf dem Array analysierten Proteine verringert wird. Der zweite kritische Schritt ist die Expression von Proteinen auf dem Mikroarray. Die Verwendung eines IVTT-Systems, das ein hohes Maß an funktionellem Protein ausdrückt, ist entscheidend für die Untersuchung der Kinase-Aktivität auf dem Array.
Der nächste wichtige Schritt beim TKI-Screening ist der Umgang mit den Mikroarrays. Die Mikroarrays sollten während eines Schritts des Protokolls nicht trocknen, und eine schonende Handhabung wird empfohlen, um Kratzer zu vermeiden, die das Hintergrundsignal erhöhen können. Da die Arrays aus dem gesamten Experiment miteinander verglichen werden, ist es wichtig sicherzustellen, dass jeder Inkubationsschritt gleichmäßig über alle Folien hinweg erfolgt. Beispielsweise sollte die Zeit berücksichtigt werden, die zum Ausführen eines Schritts in einem einzelnen Array erforderlich ist, wenn ein Batch von 20 Arrays verarbeitet wird, um Unterschiede in der Dauer der Inkubation zwischen Arrays zu vermeiden.
Schließlich sind die Konzeption des Experiments und die Einbeziehung von positiven und negativen Kontrollen für die Qualitätskontrolle und Datenanalyse von entscheidender Bedeutung. Der erste Satz von Steuerelementen sind die in jedem Array gedruckten und enthalten Negativkontrollen [d. h. leere Flecken (ohne Material gedruckt), Wasser oder leeren Vektor (nur das Tag ausdrücken)] sowie eine positivgesteuerte (d. h. gereinigte IgG, die vom sekundären Antikörper und ist inert gegenüber Veränderungen der Phosphorylierungsniveaus). Zusammen messen sie die Hintergrundpegel des Mikroarrays, die mögliche Übertragung während des Drucks und die Signalintensität der Detektionsmethode.
Die nächsten Kontrollen sind die Arzneimittel-Screening-Kontrollen und umfassen die dephosphorylierten und autophosphorylierten Mikroarrays (in Gegenwart oder Abwesenheit von DMSO). Wie bereits erwähnt, misst das dephosphorylierte Mikroarray den Phosphorylierungsgrad nach der Phosphatase-Behandlung und damit den Ausgangswert für alle anderen Experimente. Je niedriger die Basisebene ist, desto höher ist der Dynamikbereich der Assays. Die autophosphorylierten Arrays stellen die maximalen Phosphorylierungswerte aller Arrays dar und das Signal sollte stark und klar sein. Es wird für die Datenanalyse verwendet, aber auch als Kontrolle, dass alle Reaktionen erfolgreich auf dem Array durchgeführt wurden.
Einschränkungen der Technik
Ab sofort ist eine der Einschränkungen des hier vorgestellten Arzneimittelscreenings seine Fähigkeit, nur Proteinkiinasen zu überprüfen, die autophosphoryliert werden können. Eine möglichkeit, dies zu überwinden, ist, eine Kinase und ein bekanntes Substrat an der gleichen Stelle zu drucken. Der Co-Druck von DNA für zwei verschiedene Proteine wurde erfolgreich15erfolgreich durchgeführt, was auf die Machbarkeit dieses Ansatzes hindeutet. Darüber hinaus wird das auf dem Array angezeigte Protein möglicherweise nicht richtig gefaltet, was zu einem inaktiven Protein führt. Der Einsatz des humanbasierten Expressionssystems hat die kinase-Aktivität, gemessen auf dem Array, erheblich verbessert; Einige Proteine können jedoch aufgrund ihrer Inaktivität immer noch nicht auf dem Array analysiert werden.
Eine zweite Einschränkung ist die Messung der Phosphorylierung mit einem Pan-Anti-Phospho-Tyr-Antikörper. Trotz seiner Unspezifität bezüglich des Motivs der Phosphorylierungsstelle traten alle gemessenen Phosphorylierungen auf Tyrosinrückständen auf und hinterließen Serinen und Threonine und deren jeweilige Kiinasen. Bis heute wurden mehr als 10 Pan-Phospho-Ser/Thr-Antikörper trotz mehrerer Versuche zur Optimierung der Inkubations- und Waschbedingungen erfolglos getestet. Ein neues Detektionssystem, das unabhängig von Antikörpern ist, kann die beste Option sein, um die Anzahl der Proteinkiinasen zu erweitern, die auf Arzneimittelhemmung untersucht werden können. In diesem Zusammenhang stehen einige Optionen zur Verfügung, darunter Radioaktivität oder chemische Ansätze wie Klickkonjugation. Eine Reihe von Optimierungen sind erforderlich, um das Hintergrundsignal zu minimieren und einen guten Dynamikbereich für die Assays zu bieten.
Die dritte Einschränkung ist die Erfassung von cDNA-Klonen, die auf dem Array gedruckt werden sollen. Die cDNA-Klone können mit jeder Klontechnik generiert werden, einschließlich standortspezifischer Rekombinationssysteme, wie Creator oder Gateway23. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Klone aus der DNAsu-Bibliothek zu erwerben, die unter gefunden wird, wo mehr als 17.000 cDNAs-Klone, einschließlich des gesamten menschlichen Kinom, für den Bau von NAPPA-Arrays 24 leicht verfügbar sind. .
Die vierte Einschränkung ist, dass nicht jedes Labor mit geeigneten Geräten ausgestattet ist, um ihre eigenen NAPPA-Arrays herzustellen und zu prüfen. Dieses Protokoll bietet alternative Methoden zur Erzeugung der DNA, die auf das Mikroarray gedruckt werden soll, ohne dass Geräte mit hohem Durchsatz benötigt werden, sowie Protokolle, um alle Hybridisierungsschritte manuell auszuführen. Der Zugriff auf einen Arrayer und Einen Microarray-Scanner ist jedoch weiterhin erforderlich. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu beheben, ist die Nutzung des NAPPA-Kerndienstes und der NAPPA-Einrichtung, die unter zu finden ist und maßgeschneiderte NAPPA-Mikroarrays zu einem gemeinnützigen akademischen Preis vertreibt. Schließlich sind die auf den Arrays gewonnenen Daten ab jeder Screening-Methodik anfällig für Artefakte (entweder positive oder negative) und sollten daher mit orthogonalen Assays validiert werden.
Bedeutung für bestehende Methoden
Für das Screening von Proteinkiinasen stehen mehrere Plattformen im Handel zur Verfügung. Ein routinemäßig verwendeter Ansatz sind Bindungstests, die mit Proteinfragmenten, Kinase-Domäne, größeren Proteinfragmenten mit der Kinase-Domäne und einigen regulatorischen Regionen und sogar Voll-Längen-Proteinen durchgeführt werden können. Die Proteine werden in der Regel in bakteriellen Systemen aufgrund der Kosten und Einfachheit in der Expression und Reinigung Protokolle ausgedrückt. Die Wechselwirkung zwischen dem Medikament von Interesse und dem Protein wird dann mit einer Art von Berichtstest wie Fluoreszenz oder Vorhandensein von Tags gemessen, zum Beispiel. Die Hauptbeschränkung dieser Reihe von Ansätzen ist die Tatsache, dass das Protein während der Interaktion mit dem Medikament nicht unbedingt aktiv ist, was zur Identifizierung falsch positiver und falsch negativer Wechselwirkungen führen kann. Proteinfragmente sind besonders anfällig für Veränderungen der Konformation und mangelnde Aktivität, und alle erhaltenen Daten sollten mit aktiven Proteinen validiert werden, vorzugsweise in ihrer vollen Form. Eine weitere Einschränkung einiger Plattformen ist die Möglichkeit, nur ATP-Analoga zu überprüfen, wodurch die Gesamtnutzung eingeschränkt wird.
Die meisten kommerziell verfügbaren Dienstleistungen für das Screening von TKIs mit enzymatischen Ansätzen verwenden nur wilde Typversionen der Kinase von Interesse, und manchmal nur ein paar ausgewählte Mutanten. Da sie wissen, dass Arzneimittelresistenz bei Patienten, die mit TKI behandelt werden, sehr häufig ist, ist es wichtig, die Arzneimittelreaktion bei verschiedenen Mutanten messen zu können, um den am besten geeigneten Inhibitor zu ersinnen. Aufgrund der Natur von NAPPA ist das Screening von Kinase-Mutanten einfach und kann leicht durchgeführt werden, und das einzige erforderliche Werkzeug ist die Einbeziehung der Kinase-Mutante in die NAPPA cDNA-Sammlung, die beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese durchgeführt werden kann.
Zukünftige Anwendungen
Eine der häufigsten Behandlungsformen in der Krebstherapie mit Kinase-Inhibitoren ist die Erfassung von Mutationen im Wirkstoffziel während eines Behandlungskurses. Das Screening dieser Mutanten auf ihre Reaktion auf Kinase-Inhibitoren ist von entscheidender Bedeutung für die Auswahl der zweiten/dritten Generation von TKIs, um eine personalisierte Behandlung für jeden Patienten zu erreichen. Der hier vorgestellte Arzneimittel-Screening-Ansatz bietet eine unvoreingenommene Screening-Plattform, auf der jeder Tyrosinkinase-Inhibitor gegen eine Gruppe von Tyrosin-Kiinasen im menschlichen Genom getestet werden kann. Da die auf NAPPA-Arrays angezeigten Proteine in vitro aus der auf dem Dia gedruckten cDNA exprimiert werden, kann jede mutierte Variante problemlos in die cDNA-Sammlung integriert werden, die auf dem Array angezeigt werden soll. Die Anlage, in der die Kinase-Mutanten auf dem Array erzeugt und ausgedrückt werden können, in Kombination mit der hohen Durchsatzleistung der NAPPA-Technik, bietet eine einzigartige Umgebung für die Untersuchung von Kinase-Mutanten und deren Reaktion auf Medikamente, wodurch NAPPA für personalisiertes Arzneimittelscreening, eines der Ziele der Präzisionsmedizin.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei allen im LaBaer-Labor für ihre Hilfe und Kritik bei der Entwicklung des Projekts. Dieses Projekt wurde durch das NIH-Stipendium U01CA117374, U01AI077883 und Virginia G. Piper Foundation unterstützt.
Reagent/Material | |||
364 well plates (for arraying) | Genetix | x7020 | |
800 µL 96-well collection plate | Abgene | AB-0859 | |
96-pin device | Boekel | 140500 | |
Acetic Acid | Millipore-Sigma | 1.00066 | |
Acetone 99.9% | Millipore Sigma | 650501 | |
Aluminum seal for 96 well plates | VWR | 76004-236 | |
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) | Pierce | 80370 | |
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Millipore Sigma | F3165 | |
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) | Millipore Sigma | F7425 | |
ATP 10 mM | Cell Signaling | 9804S | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Millipore-Sigma | G9422 | |
bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
Blocking Buffer | ThermoFisher/Pierce | 37535 | |
Brij 35 | ThermoFisher/Pierce | BP345-500 | |
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) | ThermoFisher/Pierce | 21580 | |
BSA (bovine serum albumin) | Millipore Sigma | A2153 | |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 48393-106 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | |
DeepWell Block, case of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0661 | |
DEPC water | Ambion | 9906 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Millipore-Sigma | D8418 | |
DNA-intercalating dye | Invitrogen | P11495 | |
DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
DTT | Millipore-Sigma | 43816 | |
EDTA | Millipore-Sigma | EDS | |
Ethanol 200 proof | Millipore-Sigma | E7023 | |
Filter plates | Millipore-Sigma | WHA77002804 | |
Gas Permeable Seals, box of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0718 | |
Glass box | Wheaton | 900201 | |
Glass slides | VWR | 48300-047 | |
Glycerol | Millipore-Sigma | G5516 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Millipore-Sigma | H1758 | |
HEPES Buffer Solution | Millipore-Sigma | 83264 | |
Human-based IVTT system | Thermo Scientific | 88882 | |
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule | ThermoFisher/Pierce | 31202 | |
Isopropanol | Millipore-Sigma | I9516 | |
KCl (Potassium chloride) | Millipore-Sigma | P9333 | |
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) | Millipore-Sigma | P5655 | |
Kinase buffer | Cell Signaling | 9802 | |
KOAc (Potassium acetate) | Millipore-Sigma | P1190 | |
Lambda Protein Phosphatase | new england biolabs | P0753 | |
Lifterslips, 24 x 60 mm | ThermoFisher Scientific | 25X60I24789001LS | |
Metal 30-slide rack with no handles | Wheaton | 900234 | |
MgCL2 (Magnesium chloride) | Millipore-Sigma | M8266 | |
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) | Millipore-Sigma | S6508 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Millipore-Sigma | S3014 | |
NaOAc (Sodium acetate) | Millipore-Sigma | S2889 | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Millipore-Sigma | S8045 | |
NucleoBond Xtra Midi / Maxi | Macherey-Nagel | 740410.10 / 740414.10 | |
Nucleoprep Anion II | Macherey Nagel | 740503.1 | |
Phosphoric Acid | Millipore-Sigma | 79617 | |
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | Millipore-Sigma | A-005-C | |
Protein Phosphatase (Lambda) | New England Biolabs | P0753 | |
RNAse | Invitrogen | 12091021 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | L6026 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | 05030 | |
Sealing gasket | Grace Bio-Labs, Inc | 44904 | |
Silica packets | VWR | 100489-246 | |
Single well plate | ThermoFisher/Nalge Nunc | 242811 | |
Sodium acetate (3M, pH 5.5) | Millipore-Sigma | 71196 | |
TB media (Terrific Broth) | Millipore-Sigma | T0918 | |
Tris | IBI scientific | IB70144 | |
Triton X-100 | Millipore-Sigma | T8787 | |
Tryptone | Millipore-Sigma | T7293 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P9416 | |
Yeast Extract | Millipore-Sigma | Y1625 | |
Name | Company | Catalog number | コメント |
Equipments | Maker/model | ||
Programmable chilling incubator | Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling | ||
Shaker for bacterial growth | ATR Multitron shaker | ||
Vacuum manifold with liquid waste trap | MultiScreenVacuum Manifold 96 well | ||
96 well autopippetor/liquid handler | Genmate or Biomek FX | ||
Liquid dispenser | Wellmate | ||
DNA microarrayer | Genetix QArray2 | ||
Automatic hybridization station | Tecan HS4800 Pro Hybridization Station | ||
Microarray scanner | Tecan PowerScanner | ||
Microarray data quantification | Tecan Array-ProAnalyzer 6.3 |