Dépistage de l'inhibiteur de kinase dans les microréseaux de protéines humaines auto-assemblés

1. Les tampons et les solutions communs à utiliser Préparer le milieu de tb: Bouillon terrible (24 g/L extrait de levure; 20 g/L tryptone; 4 mL/L de glycérol; 0,017 M KH2PO4;et 0,072 M K2HPO4). Les 0,017 M KH2PO4 et 0,072 M K2HPO4 solutions peuvent être achetés comme un tampon de phosphate 10x (0,17 M KH2PO4 et 0,72 M K2HPO4). Préparer le milieu LB : Luria-Bertani (extrait de levure de 5 g/L; 10 g/L tryptone; et 10 g/L NaCl). Ajuster le pH à 7,0 avec 5 M NaOH. Préparer 1x SCT : Saline tamponnée Tris (TbS : 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 150 mM NaCl). Préparer 1x TBST: TBS complété avec 0,1% Tween 20. 2. Préparation de l’ADN REMARQUE : L’ADN utilisé pour les tableaux NAPPA doit être très pur ; par conséquent, les mini-préparations commerciales d’ADN ne sont pas recommandées. Actuellement, deux protocoles pour la préparation de l’ADN sont utilisés: dans la maison à haut débit mini-préparation (décrit ici) ou commerciale Midi- ou Maxi-prep. Le débit moyen du protocole de mini-préparation interne est de 1 500 échantillons par jour et par personne. Croissance bactérienne pour la mini-préparation interne à haut débit Préparer la plaque omni LB/Agar. Verser 30 à 40 ml d’agar LB (1,5 % d’agar bactériologique dans le média LB complété d’antibiotiques pour la sélection de clones positifs) dans chaque plaque de puits unique. Repérez le bouillon de glycérol sur la plaque LB/agar. Diluer le stock de glycérol dans les médias LB (1:300, habituellement 2 l dans 600 l de LB). Agiter pendant 10 min. Spot 3 ‘L du bouillon dilué sur la plaque LB/agar. Incuber à 37 oC, à l’envers, toute la nuit. Inoculer les cultures. À l’aide de l’appareil à 96 broches qui a été stérilisé dans 80% d’éthanol et de flamme, inoculer la culture de la plaque d’agar dans un bloc de puits profondavec 1,5 ml par puits de tb moyen complété d’antibiotiques. Incuber les cultures. Couvrir le bloc d’un joint perméable au gaz et couver de 22 à 24 h à 37 oC, 300 à 800 tr/min selon le shaker.REMARQUE : Les shakers réglés à 800 tr/min sont optimaux pour cette incubation. L’utilisation d’un shaker à vitesse plus lente peut entraîner des cultures moins denses et des rendements de purification de l’ADN plus faibles. Cultures pellet. Spin blocs à 3 800 x g et 4 oC pendant 30 min. Jeter le supernatant. Mini-préparation interne à haut débitREMARQUE : Les pipettors multicanaux ou distributeurs automatiques peuvent être utilisés pour effectuer la mini-préparation à haut débit interne. Si vous utilisez un distributeur automatique, assurez-vous de nettoyer le système avant d’utiliser et entre les solutions.Préparer toutes les solutions utilisées lors de la mini-préparation : Préparer la solution 1 : tampon de résuspension TE (50 mM Tris, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 mg/mL RNAse). Conserver à 4 oC. Préparer la solution 2 : tampon de lyse NaOH/SDS (0,2 M NaOH; 1 % SDS). Pour de meilleurs résultats, une solution fraîchement faite devrait être utilisée. Préparer la solution 3 : tampon de neutralisation KOAC (2,8 M KOAc). Ajuster le pH de la solution à 5,1 avec de l’acide acétique glaciaire. Conserver à 4 oC. Préparer la solution N2 : tampon d’équilibre (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15 % EtOH; 0,15 % Triton X-100). Ajuster le pH de la solution à 6,3 avec de l’acide phosphorique. Préparer la solution N3 : tampon bash (100 mM Tris; 1,15 M KCl; 15 % EtOH). Ajuster le pH de la solution à 6,3 avec de l’acide phosphorique. Préparer la solution N5 : tampon d’élution (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Ajuster le pH de la solution à 8,5 avec de l’acide phosphorique.REMARQUE : Le contrôle réussi de la liaison, du lavage et de l’élution de l’ADN pendant l’échange d’anion dépend fortement de la concentration et des valeurs de pH tampondeles. Des mesures soigneuses des composants tampons et un ajustement du pH sont essentiels. De petits écarts par rapport aux mesures décrites peuvent entraîner une perte importante de rendements. Suspendre à nouveau les granulés. Ajouter 200 l de la solution 1 et secouer à 2 000 tr/min pendant 5 min à RT. Une nouvelle suspension complète de la pastille est nécessaire pour réussir la lyse. Vortex le bloc si nécessaire. Lyse bactéries. Ajouter 200 l de la solution 2, sceller la plaque avec un joint en aluminium et inverser 5x. Temps soigneusement cette étape à partir du début de la solution 2 ajout. Ne pas dépasser 5 min. Neutraliser la solution. Ajouter 200 l de la solution 3, sceller la plaque avec un joint en aluminium et inverser 5x. Le joint peut être lâche en raison de la lyse / tampons de neutralisation, alors faites preuve de prudence lors de l’inversion. Une inversion partielle, dans laquelle la solution ne touche jamais le joint, est recommandée pour prévenir la contamination croisée entre les échantillons. Lysate clair. Centrifuger les plaques à 3 800 x g et 4 oC pendant 30 min. Préparer la boue de réinsine d’échange d’anion pendant l’étape de centrifugation de granule de lysate. À l’aide d’une bouteille de 1 L, remplissez-la de résine d’échange d’anions jusqu’à ce qu’elle atteigne la marque de 300 ml, puis ajoutez la solution N2 jusqu’à 900 ml.CAUTION: Cette étape doit être fait dans le capot pour se protéger contre l’inhalation de silice. Préparer des plaques de résine d’échange d’anion. Empilez les plaques de filtre sur un bloc de puits profond pour agir comme un récipient de collecte des déchets. Mélanger la boue d’échange d’anion jusqu’à ce qu’elle soit homogène, puis verser dans une auge de verre. À l’aide de conseils P1000 à gros frais, transférer 450 ll de boue dans chaque puits des plaques de filtre. Plaques empilées centrifuges (plaque de résine/plaque de puits profond) à une accélération lente pendant 5 min à 130 x g et RT. Jetez le flux à travers. Transférer le supernatant de lysate sur la plaque de résine/les piles de blocs de puits profonds. Faites tourner les plaques empilées pendant 5 min à 30 x g avec une vitesse de montée en puissance lente. Laver la colonne. Ajouter 400 l de solution N3 (tampon de lavage) à chaque puits. Transférer la plaque de résine dans le collecteur sous vide pour enlever le tampon de lavage. Répétez les étapes de lavage 3x. Lors du dernier lavage, assurez-vous que tous les puits sont bien vidés. Faites tourner les plaques de pile à 150 x g pendant 5 min pour enlever tout tampon résiduel. L’ADN d’Elute. Placer la plaque de résine sur une plaque de collecte propre de 800 ll. Ajouter 300 l de solution N5 à chaque puits. Laisser s’asseoir à RT pendant 10 min, puis faire tourner les plaques empilées pendant 5 min à 20 x g avec une vitesse de montée en puissance lente. Faire tourner les assiettes empilées pendant 1 min à 233 x g. Quantifier l’ADN et stocker les plaques à -20 oC jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ou procéder directement aux précipitations d’ADN.REMARQUE : Un minimum de 30 g d’ADN par échantillon est nécessaire. Si le rendement de l’ADN est faible, il est recommandé de répéter la mini-préparation de l’ADN, ou de combiner deux plaques pendant l’étape de précipitation (section 2.3). Précipitations d’ADN Décongeler les plaques, vortex pour homogénéiser la solution d’ADN, et tourner à 230 x g pour 30 s pour recueillir toutes les solutions dans le fond du puits. Ajouter 40 OL de 3 M NaOAc et 240 oL d’isopropanol à chaque puits. Couvrir la plaque d’un joint en aluminium et mélanger en inversant 3x. Centrifuger les plaques à 30 min à 3 800 x g et 25 oC. Jetez soigneusement le supernatant.REMARQUE : Pour combiner deux plaques, transférer l’ADN de la deuxième plaque dans la pastille de la première plaque et répéter les étapes 2.3.2-2.3.3. Laver et précipiter l’ADN. Ajouter 400 l’éthanol à 80 % de chaque puits. Plaques d’étanchéité avec joint d’aluminium et secouer à 1 000 tr/min pendant 30 min. Centrifugeà 3 800 x g pendant 30 min à 25 oC. Jetez le supernatant. Séchez les granules d’ADN. Placez les assiettes à l’envers à un angle sur des essuie-tout et laissez-les sécher pendant 1 h et 2 h, jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’alcool au fond du puits. Sceller et centrifuger à 230 x g pendant 2 min pour abaisser les granulés. Une fois les plaques sèches, sceller avec du joint d’aluminium et congeler à -20 oC pour une utilisation ultérieure ou continuer à suspendre l’ADN (étape 4.1). 3. Manteau de lamelle Aminosilane Placer les lames de verre dans un support métallique. Inspectez visuellement chaque glissière pour s’assurer qu’il n’y a pas d’égratignures ou d’imperfections. Immerger les lames dans la solution de revêtement (2% de réactif aminosilane en acétone) pendant 15 min tout en se balançant. La solution aminosilane peut être utilisée pour enrober deux racks de 30 diapositives chacun avant d’avoir besoin d’être jeté. Rincez l’étape. Immerger le toboggan dans le lavage d’acétone (99% d’acétone), secouer d’avant en arrière, puis monter et descendre rapidement 5x. Inclinez-vous vers un coin pour vous égoutter, puis immerger dans l’eau Ultrapure de haut en bas rapidement 5x. Inclinez-vous pour s’égoutter, puis placez-les sur des serviettes.REMARQUE : Le lavage d’acétone peut être utilisé deux fois, tandis que l’eau ultrapure doit être changée à chaque fois. Des toboggans secs à l’aide d’air sous pression, soufflant sur eux sous tous les angles pendant environ 3 min jusqu’à ce que toutes les gouttelettes d’eau aient été enlevées. Conservez les toboggans enduits à RT dans un support métallique à l’intérieur d’une boîte hermétiquement scellée. 4. Préparation de l’échantillon array Resuspendre le granule d’ADN de la mini-préparation interne (étape 2.3.6) dans 20 L d’eau ultrapure et secouer à 1000 tr/min pendant 2 h. Pour l’ADN de préparation midi/max, diluer chaque échantillon à une concentration finale de 1,5 g/L et transférer 20 l à une plaque de collecte de 800 l. Préparer le mélange d’impression. Pour une plaque de puits de 96, préparer 1 mL de mélange d’impression [237,5 l d’eau ultrapure; 500 l de polylysine (0,01 %); 187,5 l de BS3 (bis-sulfosuccinimidyl, 50 mg/mL en DMSO); et 75 l d’anticorps anti-lapin polyclonal)].REMARQUE : Les produits chimiques doivent être ajoutés dans l’ordre spécifié pour éviter les précipitations. Ajouter 10 l de mélange d’impression à chaque échantillon, sceller les plaques avec du papier d’aluminium, et secouer à RT pendant 90 min à 1 000 tr/min. Conserver les assiettes pendant la nuit (16 h) à 4 oC. Le jour de l’impression, brièvement vortex et faire tourner les plaques. Transférer 28 ll de chaque échantillon sur une plaque de tableau de 384. Ce transfert peut se faire à l’aide d’automatisation ou d’une pipette multicanal. Il est crucial de garder une trace de la position des échantillons dans la plaque de tableau 384. Faites tourner la plaque brièvement pour enlever les bulles. Sceller les assiettes avec du papier d’aluminium. 5. Génération de tableaux NAPPA : impression microarray REMARQUE : Toutes les conditions d’impression ont été optimisées pour l’instrument figurant dans la Table des équipements et des matériaux. Si vous utilisez un tableau différent, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire. Arrayer nettoyer. Avant de commencer, videz tous les réservoirs de déchets et remplissez les réservoirs avec de l’eau ultrapure ou 80% d’éthanol, si nécessaire. Nettoyez les épingles une par une avec des lingettes sans matière de laine et de l’eau ultrapure. Séchez les broches avec des lingettes sans matière de résineuse et placez-les soigneusement dans la tête du tableau. Tableau mis en place: spécifications d’impression [nombre maximum de timbres par encre: 1; nombre de timbres par place: 1; timing multi-timbres: –; temps d’timbre (ms): 0 ms; temps d’encrage (ms): 0 ms; réglage de profondeur d’impression: 90 microns; nombre de touch-offs: 0]. protocole de stérilisation : lavage à l’eau ultrapure pour 2 000 ms avec 0 ms de temps de séchage et 500 ms de temps d’attente; répéter ces étapes 6x; suivi d’un lavage à 80 % d’éthanol pour 2 000 ms avec 1 200 ms de temps de séchage et 500 ms de temps d’attente; répéter ces étapes 6x. Conception de diapositive : configurez le tableau avec le modèle de tableau désiré. La conception doit tenir compte de plusieurs facteurs [c.-à-d., le nombre de répliques pour chaque échantillon, l’emplacement et le nombre des fonctions de contrôle, la disposition du tableau (un bloc, plusieurs blocs identiques), le nombre de tableaux à imprimer, la durée de la course, etc.]. Placez les toboggans enduits d’aminosilane (étape 3.4) sur le pont de l’tableau. Vérifiez si le vide maintient toutes les glissières en place en toute sécurité. Démarrer l’humidificateur (il doit être fixé à 60%). Placez la plaque de puits 384 sur le pont de l’escalier. Démarrez le programme. Étiqueter les microréseaux. Lorsque l’impression est terminée, placez les étiquettes de diapositives sur le côté inférieur (non imprimé) de chaque diapositive. Maintenir l’ordre d’impression de diapositives sur le pont dans l’ordre numérique. Rangez les tableaux imprimés à RT dans un support métallique à l’intérieur d’une boîte hermétiquement scellée avec un paquet de silice. Les glissières conservées dans un environnement sec ont une durée de conservation pouvant aller jusqu’à un an. (Facultatif) : un deuxième lot de 90 diapositives peut être imprimé à l’aide des mêmes échantillons. Pour ce faire, retirez la plaque de puits 384 de la plate-forme de l’escalier dès que l’impression de la plaque est terminée. Sceller et conserver l’assiette à 4 oC. Une fois que le premier lot de tableaux est complètement terminé, retirez-les du pont, placez de nouveaux toboggans enduits d’aminosilane et commencez une nouvelle course. Assurez-vous que chaque plaque de puits 384 est à RT pendant 30 minutes avant son utilisation. Si plus de quatre répliques par échantillon sont imprimées dans un lot de diapositives, il est recommandé de diviser les 384 plaques de puits en deux plaques pour diminuer l’évaporation de l’échantillon en diminuant le temps passé sur le pont de l’escalier.REMARQUE : Vérifiez tous les réservoirs avant le début de la deuxième manche. 6. Détection de l’ADN sur les diapositives NAPPA Bloquez les diapositives. Placez les diapositives dans une boîte de pipette et ajoutez 30 ml de tampon de blocage. Incuber à RT pendant 1 h sur un shaker à bascule. Tachez les diapositives. Jetez la solution de blocage et ajoutez 20 ml de tampon de blocage et 33 l de colorant fluorescent intercalateur d’ADN. Incuber pendant 15 min avec agitation. Ensuite, rincez rapidement les glissières à l’eau ultrapure et séchez-les avec de l’air sous pression. Procéder à la numérisation (article 11). 7. Expression des diapositives NAPPA Bloquer les glissières avec un tampon de blocage sur un shaker à bascule à RT pendant 1 h. Utilisez environ 30 ml dans une boîte de pipette pour quatre diapositives. Rincer les toboggans à l’eau ultrapure et sécher à l’air comprimé filtré. Appliquer le joint d’étanchéité sur chaque diapositive selon les instructions du fabricant. Ajouter le mélange IVTT. Chaque diapositive nécessitera 150 ll de mélange IVTT. Diluer 82,5 l de lysate HeLa dans 33 l’eau DEPC et compléter avec 16,5 l de protéines accessoires et 33 uL de mélange de réaction. Ajouter le mélange IVTT de l’extrémité non-étiquette ou non-spécimen. Pipette le mélange dans lentement (il est acceptable si elle perle temporairement à l’extrémité de l’enlet). Masser délicatement le joint d’étanchéité afin que le mélange IVTT s’étende et couvre toute la zone du tableau. Appliquer les petits joints de port ronds sur les deux ports. Placez les glissières sur un support et transférez-les à l’incubateur de refroidissement programmable. Incuber pendant 90 min à 30 oC pour l’expression des protéines, suivi de 30 min à 15 oC pour l’immobilisation de la protéine requête. Laver et bloquer les diapositives. Retirez le joint d’étanchéité et plongez les glissières dans une boîte à pipettes avec environ 30 ml de 1x TBST complétés par 5 % de lait pour l’affichage des protéines (section 8) ou 1x TBST complétés par de l’albumine de sérum bovin (BSA) de 3 % pour les analyses de kinase ou le dépistage des médicaments (section 9). Incuber à RT avec agitation pendant 20 min et répéter cette étape 2x. 8. Détection des protéines sur les tableaux NAPPA Ajouter l’anticorps primaire. Retirez les diapositives de la solution de blocage (étape 7.5) et séchez doucement le côté arrière (côté non imprimé) à l’aide d’un essuie-tout. Placez les diapositives sur un support et appliquez 600 l d’anticorps primaires (anti-drapeau de souris) dilués 1:200 dans 1x TBST et 5% de lait. Incuber pour 1 h à RT. Laver les lames avec 1x TBST et 5% de lait sur un shaker à bascule (3x pour 5 min chacun). Ajouter l’anticorps secondaire. Retirer les lames de la solution de lavage et sécher doucement le côté arrière à l’aide d’essuie-tout. Placez les diapositives sur un support et appliquez 600 l d’anticorps secondaires (anticorps antisouris cy3-labbeled) dilués 1:200 dans 1x TBST et 5% de lait. Protégez les glissières de la lumière et incuber pendant 1 h à RT. Laver les lames avec 1x TBST sur un shaker à bascule (3x pour 5 min chacun). Rincer rapidement les glissières à l’eau ultrapure et sécher à l’aide d’air sous pression. Procéder à la numérisation (article 11). 9. Dépistage des inhibiteurs de la kinase tyrosine sur les tableaux NAPPA REMARQUE : Plusieurs diapositives peuvent être traitées dans la même expérience, cependant, assurez-vous que dans chaque étape, une diapositive est traitée à la fois et qu’ils ne sèchent pas entre les étapes. Ajoutez toutes les solutions à l’extrémité non-étiquette ou non-spécimen de la diapositive. Préparer toutes les solutions utilisées lors du dépistage des médicaments : Préparer la solution phosphatase/DNase en combinant les éléments suivants : 1x protéine metallo-phosphatases tampon (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,01% Brij 35 à pH – 7,5); 1 mM Mm MnCl2; 8 000 unités de phosphatase de protéine lambda; et 2 unités de DNase I. Préparez 400 L de la solution pour chaque microarray. Ajouter la phosphatase et le DNase juste avant l’utilisation. Faire la dilution de la drogue. Les médicaments sont reconstitués dans DMSO à une concentration finale de 10 mM. Pour s’assurer que toutes les concentrations de médicaments testées sur le tableau, assurez-vous que le même volume de DMSO (un stock de 10 000x dans le DMSO) est créé pour chaque concentration et maintenu à -80 oC. Au moment de l’utilisation, les médicaments sont dilués 1:100 dans l’eau. Préparer la solution médicament/kinase en combinant ce qui suit : 1x tampon kinase (25 mM Tris-HCl de pH à 7,5); 5 mM de bêta-glycérophosphate; 2 mM DTT; 0,1 mM Na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 M ATP; et 2 L de médicament (dilué 1:100 dans l’eau). Préparer 200 L de la solution pour chaque microarray. Effectuer le traitement de la phosphatase et de la DNase. Retirez les glissières de la solution de blocage (étape 7.5) et séchez doucement le dos à l’aide d’un essuie-tout. Placez les diapositives sur le support et appliquez 200 l de la solution phosphatase/DNase. Placez un bordereau de microarray pour éviter l’évaporation. Incuber à 30 oC pendant 45 min au four. Traitement de la phosphatase et de la DNase II : retirer les tableaux du four, jeter la glissière de couverture, enlever la solution excédentaire et appliquer 200 ll de la solution de phosphatase et de DNase fraîchement fabriquée. Couvrir les microréseaux de la couverture et incuber pendant 45 min de plus à 30 oC au four. Laver les toboggans avec 1x TBST et 0,2 M NaCl sur un shaker à bascule (3x pour 5 min chacun). Effectuer le traitement médicamenteux et la réaction kinase. Retirer les glissières de la solution de lavage et sécher doucement le dos à l’aide d’un essuie-tout. Placez les diapositives sur le support et appliquez 200 L de solution médicament/kinase. Placez un bordereau sur le dessus pour éviter l’évaporation. Incuber pendant 1 h à 30 oC au four. Laver les toboggans avec 1x TBST et 0,2 M NaCl sur un shaker à bascule (3x pour 5 min chacun). Répéter les étapes 8.1-8.4 en utilisant comme anticorps anti-phosho-Tyr d’anticorps primaires dilués 1:100. Remplacer 1x TBST et 5 % de lait à toutes les étapes par 1 x TBST et 3 % de BSA. 10. Protocole d’hybridation automatisé REMARQUE : Alternativement, une station d’hybridation peut être utilisée pour automatiser toutes les hybridations et lavages sur les tableaux NAPPA (sections 7 à 9) et le protocole est fourni sous forme de fichier supplémentaire 1. 11. Acquisition d’images REMARQUE : Les images microarray doivent être acquises à une résolution de 20 microns ou plus. Chargez les microréseaux dans le chargeur de curseur avec les protéines orientées vers le haut. Chargez le chargeur dans le scanner de microarray. Sélectionnez le laser vert avec un filtre d’émission de 575/30 nm pour scanner le signal de l’anticorps secondaire étiqueté cy-3. Si un fluorophore différent est utilisé, sélectionnez le laser/longueur d’onde correct pour détecter le signal du colorant fluorescent. Définissez le nom de chaque image et l’emplacement qu’elles seront enregistrées. (Facultatif) : pour chaque nouveau fluorophore, l’optimisation des conditions de balayage est recommandée pour détecter la plage linéaire de l’intensité du signal. Pour ce faire, scanner un microréseau à l’aide d’une gamme de photomultiplicateurs (PMT) et gagner jusqu’à ce qu’une image claire soit obtenue avec un signal non saturé et un fond faible. Scannez tous les microréseaux avec les paramètres optimisés et n’oubliez pas d’éteindre l’autogain.REMARQUE : Pour l’analyse des données, tous les microréseaux doivent être numérisés à l’aide des mêmes paramètres de numérisation. Pour les essais de kinase utilisant le cy3 comme fluorophore, les images sont numérisées avec un PMT de 20%, une intensité laser de 25%, et 10 microns de résolution, à l’aide du scanner répertorié dans le Tableau de l’équipement et des matériaux. 12. Traitement et analyse des données REMARQUE : Plusieurs progiciels sont disponibles pour la quantification des données de microarray avec des capacités similaires. La procédure décrite ici a été conçue pour le logiciel figurant dans la Table des équipements et des matériaux. Chargez les fichiers TIFF pour être quantifiés, concevez la grille pour correspondre à la disposition du microréseau et ajustez la taille des taches pour incorporer l’ensemble du signal avec la surface minimale possible. Les endroits voisins ne doivent pas se chevaucher. Inspectez visuellement la performance du logiciel et ajustez la grille manuellement, si nécessaire. Quantifier l’intensité du signal du microréseau. Inspectez visuellement les taches pour décevoir toute anomalie (liaison non spécifique, poussière, etc.) et retirez-les de l’analyse des données. Corriger l’arrière-plan localement en utilisant le signal des zones voisines sur le tableau dans lequel aucun endroit n’est présent. Normaliser les données. Pour comparer le signal entre différents tableaux, l’intensité du signal de chaque microréseau doit être normalisée. Pour exclure les valeurs aberrantes, normaliser les données à l’aide de la moyenne de 30% du signal du contrôle positif (taches IgG) des microréseaux déphosphorylés.REMARQUE : Le signal de la tache d’IgG ne change pas pendant la phosphorylation et la déphosphorylation des microarrays et convient à la normalisation. Identifiez les kinases actives. Pour chaque entité affichée sur le microréseau, calculez le rapport entre l’intensité du signal normalisé edans les tableaux autophosphorylés et les tableaux déphosphorylés. Fixez un seuil de 1,5 fois pour l’identification des kinases actives et marquez toutes les autres caractéristiques comme incapables de subir une autophosphorylation (N/A). Calculer l’activité de chaque kinase identifiée à l’étape 12.5 en pourcentage du signal ajusté (intensité du signal du tableau de contrôle positif normalisé (DMSO) soustrait par l’intensité du signal du tableau de contrôle négatif normalisé (déphosphoryé).