JoVE Journal > Biochemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生化学

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Published: October 23, 2019
doi:
10.3791/59886
,
1Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute,Arizona State University, 2Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine,Pennsylvania State University

概要

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Abstract

De screening van kinase remmers is cruciaal voor een beter begrip van de eigenschappen van een medicijn en voor de identificatie van potentieel nieuwe doelen met klinische implicaties. Er zijn verschillende methodologieën gemeld om deze screening te volbrengen. Echter, elk heeft zijn eigen beperkingen (bijv. de screening van alleen ATP-analogen, beperking tot het gebruik van gezuiverde kinase domeinen, aanzienlijke kosten in verband met het testen van meer dan een paar kinases tegelijk, en gebrek aan flexibiliteit bij het screenen van eiwit kinasen met nieuwe mutaties). Hier, een nieuw protocol dat enkele van deze beperkingen overkomt en kan worden gebruikt voor de onbevooroordeelde screening van kinase remmers wordt gepresenteerd. Een sterkte van deze methode is de mogelijkheid om te vergelijken van de activiteit van kinase remmers over meerdere eiwitten, hetzij tussen verschillende kinases of verschillende varianten van hetzelfde kinase. Zelf-geassembleerde eiwit micro arrays gegenereerd door de expressie van eiwit kinases door een mens gebaseerde in vitro transcriptie en vertaalsysteem (IVTT) worden gebruikt. De eiwitten die op de microarray worden weergegeven zijn actief, waardoor de effecten van kinase remmers kunnen worden gemeten. De volgende procedure beschrijft de stappen van het protocol in detail, van de microarray generatie en screening naar de gegevensanalyse.

Introduction

Proteïne kinases zijn verantwoordelijk voor de fosforylering van hun doelen en kunnen complexe moleculaire trajecten moduleren die veel cellulaire functies beheersen (d.w.z. celproliferatie, differentiatie, celdood en overleving). Deregulering van kinase activiteit wordt geassocieerd met meer dan 400 ziekten, het maken van kinase remmers een van de belangrijkste klassen van geneesmiddelen beschikbaar voor de behandeling van verschillende ziekten, met inbegrip van Cancer, cardiovasculaire en neurologische aandoeningen, alsmede inflammatoire en auto-immuunziekten1,2,3.

Met de komst van precisie geneeskunde, de identificatie van nieuwe therapieën, vooral kinase remmers, hebben een grote aantrekkingskracht farmaceutisch en klinisch. Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt voor de identificatie van mogelijke nieuwe paren van kinase/kinase remmers, met inbegrip van de de Novo ontwerp van kinase remmers en identificatie van nieuwe doelstellingen voor bestaande FDA-goedgekeurde geneesmiddelen. Dit laatste is vooral aantrekkelijk, omdat de tijd en het geld die nodig zijn voor de uitvoering van deze geneesmiddelen in klinieken drastisch worden verlaagd als gevolg van de beschikbaarheid van eerdere klinische proefgegevens. Een canoniek voorbeeld van de herbestemming van een kinase remmer is Imatinib, aanvankelijk ontworpen voor de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) door de remming van BCR-ABL, die ook met succes kan worden gebruikt voor de behandeling van c-Kit over-uitdrukken gastro-intestinale stromale tumoren (gists)4,5,6,7.

De screening van kinase remmers kan worden uitgevoerd in bindende assays of op enzymatische gebaseerde testen. De eerste klasse van assays richt zich op de interacties van eiwit-geneesmiddelen en kan informatie verschaffen zoals ligatie plaats en affiniteit. Aangezien de activiteit van het kinase op het moment van deze tests onbekend is, kan een aantal interacties worden gemist of ten onrechte worden geïdentificeerd als gevolg van conformationele veranderingen in het eiwit. Aan de andere kant vereisen enzymatische assays dat de eiwit kinasen actief zijn en waardevolle informatie verstrekken over het effect van de remmer op enzymactiviteit, maar dit type screening is over het algemeen meer tijdrovend en duur. Op dit moment zijn beide typen assays commercieel beschikbaar vanuit verschillende bronnen. Ze vertegenwoordigen een betrouwbare optie voor de screening van kinase remmers met enkele beperkingen, waaronder: I) de meeste methoden omvatten het testen van meerdere kinasen afzonderlijk, waardoor de screening van een groot aantal eiwitten kostbaar kan zijn; II) de te testen set kinases is beperkt tot een lijst van vooraf gekozen, wild-type kinasen en verschillende bekende gemuteerde versies van sommige kinasen, waardoor het testen van vele nieuwe gemuteerde isoforms wordt belemmerd.

In deze context zijn eiwit arrays een krachtig platform dat een aantal van de beperkingen die door commercieel verkrijgbare technieken worden voorgesteld, kan overwinnen. Het is geschikt om op enzymatische gebaseerde assays uit te voeren in een screening met hoge doorvoer met behulp van volledige, actieve eiwitten van een willekeurige reeks van belang. De micro arrays kunnen worden gegenereerd door een zelf-geassembleerde benadering zoals NAPPA (nucleïnezuur programmeerbare eiwit array), waarbij eiwitten net op tijd worden uitgedrukt voor de assays, waardoor de kans toeneemt dat die weergegeven op de array inderdaad actief zijn. De op NAPPA getoonde eiwitten worden geproduceerd met behulp van met de mens afgeleide ribosomen en chaperonne eiwitten om de waarschijnlijkheid van natuurlijke vouwen en activiteit te verbeteren.

De eiwitten worden in eerste instantie geprogrammeerd door het afdrukken van cDNAs-codering voor genen van belang gefuseerde met een Capture-tag, samen met een Capture-agent, op het microarray-oppervlak. De eiwitten worden vervolgens geproduceerd op de micro arrays met behulp van een in vitro transcriptie-en vertaalsysteem (IVTT), en de vers uitgedrukte eiwitten worden geïmmobiliseerd op het microarray-oppervlak door de Capture-agent. Uitgedrukt nappa arrays kunnen worden gebruikt voor de studie van de eiwitten weergegeven op de array in een onbevooroordeelde, hoge doorvoer manier8,9.

Eerder werd aangetoond dat eiwitten die worden weergegeven op NAPPA-arrays correct worden gevouwen om te communiceren met bekende partners10; Bovendien werd hun enzymatische activiteit voor het eerst uitgebuit in 2018, toen werd aangetoond dat eiwit kinasen weergegeven op de microarray autophosphorylate11. Tot op heden is nappa methodologie gebruikt voor vele verschillende toepassingen, waaronder biomarker Discovery12,13,14,15,16,17, eiwit-eiwit interacties10,18, substraat identificatie19, en drug screening11. De flexibiliteit is een van de belangrijkste kenmerken van het platform die aanpassing aan elke toepassing mogelijk maakt.

Hier wordt een protocol voor de screening van tyrosine kinase remmers in zelf-geassembleerde NAPPA arrays gepresenteerd. Het platform is geoptimaliseerd voor de weergave van actieve menselijke eiwit kinasen en voor de analyse van proteïne kinase activiteit, met een lage achtergrond en een hoog dynamisch bereik. Onder de wijzigingen die zijn geïmplementeerd om NAPPA te gebruiken voor de screening van kinase remmers zijn: I) veranderingen in de druk chemie, II) de-fosforylering van de proteïne Microarray voorafgaand aan de screening van de kinase remmer, en III) optimalisatie van de detectie van gefosforyleerd eiwitten op de array. Dit protocol is de eerste in zijn soort en biedt unieke informatie over de kinase studie in NAPPA micro arrays.

Protocol

1. gemeenschappelijke buffers en oplossingen die moeten worden gebruikt Bereid TB medium: geweldige Bouillon (24 g/L gistextract; 20 g/L Tryptone; 4 mL/L glycerol; 0,017 M KH2po4; en 0,072 M K2HPO4). De 0,017 M KH2po4 en 0,072 m k2HPO4 oplossingen kunnen worden aangeschaft als een 10x fosfaatbuffer (0,17 m KH2po4 en 0,72 M k2HPO4). Voorbereiding LB medium: Luria-Bertani (5 g/L gistextract; 10 g/L Tryptone; en 10 g/L NaCl). Stel de pH in op 7,0 met 5 M NaOH. Bereid 1x TBS: tris-gebufferde zoutoplossing (TBS: 50 mM tris-cl, pH = 7,5; 150 mM NaCl). Bereid 1x TBST: TBS aangevuld met 0,1% Tween 20. 2. DNA-voorbereiding Opmerking: het DNA dat gebruikt wordt voor NAPPA arrays moet zeer zuiver zijn; Daarom worden commerciële DNA mini-Preps niet aanbevolen. Momenteel worden twee protocollen voor DNA-voorbereiding gebruikt: in huis High-throughput mini-prep (hier beschreven) of commerciële MIDI-of Maxi-prep. De gemiddelde doorvoer van het in-House mini-prep protocol is per dag 1.500 samples. Bacteriële groei voor in-House High-throughput mini-prep Bereid LB/agar Omni Plate. Giet 30 – 40 mL LB agar (1,5% bacteriologisch agar in LB media aangevuld met antibiotica voor selectie van positieve klonen) in elke enkele put. Spot glycerol voorraad op LB/agar plaat. Verdun glycerol kolf in LB media (1:300, gewoonlijk 2 μL in 600 μL LB). Schud gedurende 10 min. spot 3 μL van de verdunde kolf op de LB/agar plaat. Inincuberen bij 37 °C, ondersteboven, ‘s nachts. Inoculeren culturen. Met behulp van de 96-PIN-apparaat dat werd gesteriliseerd in 80% ethanol en vlam, inoculeren de cultuur van de agar plaat in een diep-goed blok met 1,5 mL per goed van TB medium aangevuld met antibiotica. Incubate culturen. Bedek het blok met een gasdoorlatbare afdichting en inincuberen voor 22 – 24 uur bij 37 °C, 300 – 800 rpm Afhankelijk van Shaker.Let op: Shakers ingesteld op 800 rpm zijn optimaal voor deze incubatie. Het gebruik van een langzamere snelheids Shaker kan resulteren in minder dichte culturen en lagere DNA-zuiverings opbrengsten. Pellet culturen. Spin blokken bij 3.800 x g en 4 °c gedurende 30 min. Gooi supernatant weg. In-House mini-prep met hoge doorvoerOpmerking: Multi-Channel pipetten of automatische dispensers kunnen worden gebruikt om de in-House High-throughput mini-prep uit te voeren. Als u een automatische dispenser gebruikt, zorg er dan voor dat u het systeem vóór gebruik en tussenoplossingen schoon maakt.Bereid alle oplossingen voor die tijdens de mini-prep worden gebruikt: Bereiding oplossing 1: te resuspensie buffer (50 mm tris, pH = 8,0; 10 mm EDTA, pH = 8,0; 0,1 mg/ml RNase). Bewaren bij 4 °C. Bereid oplossing 2: NaOH/SDS lysis buffer (0,2 M NaOH; 1% SDS). Voor betere resultaten moet een versbereide oplossing worden gebruikt. Bereid oplossing 3: KOAC neutralisatie buffer (2,8 M KOAc). Stel de pH van de oplossing in op 5,1 met ijsazijn. Bewaren bij 4 °C. Oplossing voorbereiden N2: equilibratie buffer (100 mM tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0,15% Triton X-100). Stel de pH van de oplossing in op 6,3 met fosforzuur. Oplossing voorbereiden N3: bash buffer (100 mM tris; 1,15 M KCl; 15% EtOH). Stel de pH van de oplossing in op 6,3 met fosforzuur. Bereiding oplossing N5: elutie buffer (100 mM tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Stel de pH van de oplossing in op 8,5 met fosforzuur.Opmerking: succesvolle controle van de DNA-binding, wassen en elutie tijdens anion-uitwisseling is sterk afhankelijk van de buffer KCl-concentratie en pH-waarden. Zorgvuldige buffer component metingen en pH-aanpassing zijn essentieel. Kleine afwijkingen van de beschreven metingen kunnen resulteren in significant verlies van opbrengsten. Pellet opnieuw opschorten. Voeg 200 μL oplossing 1 toe en schud bij 2.000 rpm gedurende 5 minuten bij RT. volledige hersuspensie van de pellet is noodzakelijk voor succesvolle lysis. Vortex het blok indien nodig. Lyse bacteriën. Voeg 200 μL oplossing 2 toe, sluit de plaat af met een aluminium afdichting en keer 5x om. Voorzichtig tijd deze stap vanaf het begin van de oplossing 2 optellen. Niet meer dan 5 min. Neutraliseer de oplossing. Voeg 200 μL oplossing 3 toe, sluit de plaat af met een aluminium afdichting en keer 5x om. De afdichting kan loskomen als gevolg van de lysis/neutralisatie buffers, dus wees voorzichtig bij het inverteren. Een gedeeltelijke inversie, waarbij de oplossing nooit de afdichting raakt, wordt aanbevolen om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen. Helder lysaat. Centrifugeer de platen gedurende 30 minuten bij 3.800 x g en 4 °c. Bereid anion wissel hars slurry tijdens de lysaat omhullingen centrifugeren stap. Gebruik een flesje van 1 L, vul het met de anion-wisselingshars totdat het de 300 mL-markering bereikt en voeg vervolgens oplossing N2 toe tot 900 mL.Let op: deze stap moet worden gedaan in de kap te beschermen tegen silica inademing. Bereid anion uitwisselings hars platen. Stapel de filterplaten bovenop een diepe put om te fungeren als een afvalinzamel vaartuig. Meng de anion-wissel slurry tot deze homogeen is en giet vervolgens in een glazen goot. Gebruik Wide-vervelen P1000 tips en breng 450 μL van de slurry over in elke put van de filterplaten. Centrifugeer gestapelde platen (Resin Plate/Deep well plate) bij langzame acceleratie gedurende 5 minuten bij 130 x g en RT. Gooi de stroom door. Breng lysaat supernatant op de hars plaat/diepe put blok stapels. Draai de gestapelde platen gedurende 5 minuten bij 30 x g met een langzame aanloop snelheid. Kolom wassen. Voeg 400 μL oplossing N3 (wasbuffer) toe aan elk goed. Breng de hars plaat over naar de vacuüm variëteit om de wasbuffer te verwijderen. Herhaal de wasstappen 3x. Zorg er bij de laatste wasbeurt voor dat alle putjes goed geleegd zijn. Draai de stapel platen gedurende 5 minuten bij 150 x g om eventuele rest buffer te verwijderen. Elute DNA. Plaats de hars plaat op een schone 800 μL-opvang plaat. Voeg aan elk goed 300 μL oplossing N5 toe. Laat het 10 minuten op RT zitten en draai de gestapelde platen gedurende 5 minuten bij 20 x g met een langzame aanloop snelheid. Draai de gestapelde platen gedurende 1 minuut bij 233 x g. Kwantificeer DNA en bewaar platen bij-20 °C tot verder gebruik of ga rechtstreeks naar DNA-neerslag.Opmerking: er is minimaal 30 μg DNA per monster nodig. Als de DNA-opbrengst laag is, wordt aanbevolen om de DNA mini-prep te herhalen, of als alternatief twee platen te combineren tijdens de neerslag stap (punt 2,3). DNA-neerslag Ontdooien van platen, Vortex om de DNA-oplossing te homogeniseren, en spin op 230 x g voor 30 s om alle oplossing in de bodem van de put te verzamelen. Voeg aan elk goed 40 μL van 3 M NaOAc en 240 μL isopropanol toe. Bedek de plaat met een aluminium afdichting en meng door 3x te inverteren. Centrifugeer de platen gedurende 30 minuten bij 3.800 x g en 25 °c. Gooi het supernatant voorzichtig weg.Let op: om twee platen te combineren, breng het DNA van de tweede plaat in de pellet van de eerste plaat en herhaal stappen 2.3.2 – 2.3.3. Was en neerslaan van het DNA. Voeg 400 μL 80% ethanol toe aan elk goed. Afdichtings platen met aluminium afdichting en schud bij 1.000 rpm gedurende 30 min. Centrifugeer bij 3.800 x g gedurende 30 minuten bij 25 °c. Gooi het supernatant weg. Droog de DNA-pellets. Plaats de platen ondersteboven onder een hoek op papieren handdoeken en laat ze drogen voor 1 – 2 h, totdat er geen alcohol aanwezig is aan de onderkant van de put. Seal en centrifugeer bij 230 x g gedurende 2 minuten om eventuele pellets naar beneden te brengen. Zodra de platen droog zijn, ofwel afdichten met aluminium afdichting en bevriezen bij-20 °C voor later gebruik of blijven het DNA hervatten (stap 4,1). 3. aminosilane glij coating Plaats de glaasjes in een metalen rek. Inspecteer elke dia visueel om te zorgen dat er geen krassen of onvolkomenheden aanwezig zijn. Submerge dia’s in coating oplossing (2% genoemde reagens in aceton) gedurende 15 minuten tijdens het schommelen. De aminosilaanoplossing kan worden gebruikt om twee rekken van 30 glaasjes elk te kapen voordat het moet worden weggegooid. Spoel stap. Dompel de Slide rack in aceton Wash (99% aceton), schud heen en weer, dan snel omhoog en omlaag 5x. Kantel naar een hoek om af te druppelen, en dompel vervolgens in ultrapuur water op en neer snel 5x. Kantel om af te druppelen, plaats dan op servetten.Opmerking: aceton Wash kan tweemaal worden gebruikt, terwijl het ultrapuur water elke keer moet worden vervangen. Droge dia’s met behulp van perslucht, blazen op hen uit alle hoeken voor ongeveer 3 minuten totdat alle waterdruppels zijn verwijderd. Bewaar de gecoate slides op RT in een metalen rek in een strak afgesloten doos. 4. array monstervoorbereiding Rebreng de DNA-pellet uit de in-House mini-prep (stap 2.3.6) in 20 μL ultrapuur water en schud bij 1.000 rpm gedurende 2 h. Voor MIDI/Max prep DNA, Verdun elk monster tot een eindconcentratie van 1,5 μg/μL en breng 20 μL over in een verzamel plaat van 800 μL. Druk mengsel voorbereiden. Voor de 1 96 goed plaat, bereid 1 mL drukmix [237,5 μL ultrapuur water; 500 μL poly lysine (0,01%); 187,5 μL van BS3 (bis-sulfosuccinimidyl, 50 mg/mL in DMSO); en 75 μL polyklonale Anti-Flag konijn antilichamen)].Opmerking: de chemicaliën moeten worden toegevoegd in de opgegeven volgorde om neerslag te voorkomen. Voeg 10 μL drukmix toe aan elk monster, afdichtings platen met aluminiumfolie en schud bij RT voor 90 min bij 1.000 rpm. Bewaar de platen ‘s nachts (~ 16 uur) bij 4 °C. Draai de platen kort op de drukdag. Breng 28 μL van elk monster over naar een 384-array plaat. Deze overdracht kan worden gedaan met behulp van automatisering of een meerkanaals pipet. Het is cruciaal om de positie van de monsters in de 384-array plaat bij te houden. Draai de plaat kort om eventuele bubbels te verwijderen. Sluit de platen af met folie. 5. generatie NAPPA arrays: Microarray Printing Opmerking: alle afdruk condities zijn geoptimaliseerd voor het instrument dat wordt vermeld in de tabel met apparatuur en materialen. Als u een andere array gebruikt, kan verdere optimalisatie nodig zijn. Arrayer clean up. Voordat u begint, leeg alle afvaltanks en vul de reservoirs met ultrapuur water of 80% ethanol, indien nodig. Reinig de pinnen één voor één met pluisvrije doekjes en ultrapuur water. Droog de pennen met pluisvrije doekjes en plaats ze voorzichtig terug in de arrayer Head. Arrayer set up: specificaties afdrukken [maximum aantal postzegels per inkt: 1; aantal postzegels per spot: 1; multi-Stamp timing:–; stempel tijd (MS): 0 MS; inkt tijd (MS): 0 MS; afdruk diepte aanpassing: 90 micron; aantal aanraak-offs: 0]. Volg vervolgens de sterilisatie Protocol: ultrapuur water wassen voor 2.000 MS met 0 MS droogtijd en 500 MS wachttijd; Herhaal deze stappen 6x; gevolgd door wassen met 80% ethanol voor 2.000 MS met 1.200 MS droogtijd en 500 MS wachttijd; Herhaal deze stappen 6x. Ontwerp van de dia: Stel de arrayer in met het gewenste arraying-patroon. In het ontwerp moet rekening worden gehouden met verschillende factoren [d.w.z. het aantal replica’s voor elk monster, de locatie en het nummer van de besturingselementen, de indeling van de array (één blok, verschillende identieke blokken), het aantal arrays dat moet worden afgedrukt, de lengte van de uitvoering, enz.]. Plaats de met aminosilaan gecoate glijbanen (stap 3,4) op het arrayer-dek. Controleer of het vacuüm alle dia’s stevig op zijn plaats houdt. Start de bevochtiger (deze moet worden ingesteld op 60%). Plaats de 384 well plate op het arrayer deck. Start het programma. Label de micro arrays. Wanneer het afdrukken is voltooid, plaatst u de diapabels aan de onderzijde (niet-bedrukte zijde) van elke dia. De afdrukvolgorde van dia’s op het deck in numerieke volgorde onderhouden. Bewaar de bedrukte arrays op RT in een metalen rek in een strak verzegelde doos met een silica-verpakking. Dia’s die in een droge omgeving worden gehouden, hebben een houdbaarheid tot een jaar. (Optioneel): een tweede batch van 90 dia’s kan worden afgedrukt met behulp van dezelfde monsters. Om dit te doen, verwijder de 384 goed plaat van het arrayer deck zodra het afdrukken van de plaat is gedaan. Sluit de plaat af en bewaar deze op 4 °C. Nadat de eerste serie arrays volledig is uitgevoerd, verwijdert u ze van het deck, plaatst u nieuwe genoemde gecoate dia’s en start u een nieuwe run. Zorg ervoor dat elke 384 goed plaat is bij RT voor 30 minuten voorafgaand aan het gebruik ervan. Als meer dan vier replica’s per sample worden afgedrukt in een batch van dia’s, is het raadzaam om de 384 goed platen in twee platen te splitsen om de verdamping van het monster te verminderen door de hoeveelheid tijd die aan het arrayer-dek wordt besteed te verminderen.Opmerking: Controleer alle reservoirs vóór het begin van de tweede run. 6. detectie van DNA op NAPPA slides Blokkeer de dia’s. Plaats de dia’s in een pipet en Voeg 30 mL blokkerende buffer toe. Incuberen bij RT voor 1 uur op een schommel Shaker. Vlekken op de dia’s. Gooi de blokkerende oplossing weg en Voeg 20 mL blokkerende buffer en 33 μL fluorescerende DNA-intercalciërende kleurstof toe. Incuberen gedurende 15 minuten met roeren. Spoel de dia’s vervolgens snel af met ultrapuur water en droog met perslucht. Ga verder met het scannen (paragraaf 11). 7. expressie van NAPPA slides Blokkeer de dia’s met blokkerende buffer op een schommel Shaker bij RT voor 1 uur. gebruik ongeveer 30 mL in een pipet voor vier dia’s. Spoel dia’s af met ultrapuur water en droog met gefilterde perslucht. Breng de afdichtings pakking aan op elke dia volgens de instructies van de fabrikant. Voeg IVTT mix toe. Voor elke glijbaan is 150 μL IVTT-mengsel nodig. Verdun 82,5 μL HeLa lysaat in 33 μL DEPC water en vul aan met 16,5 μL accessoire-eiwitten en 33 uL van de reactiemix. Voeg IVTT-mengsel toe van het niet-etiket of niet-specimen uiteinde. Pipetteer het mengsel langzaam (het is aanvaardbaar als het tijdelijk aan het inlaat uiteinde wordt kralen). Masseer de afdichtings pakking zachtjes zodat de IVTT-mix zich verspreidt en het hele gebied van de array bedekt. Breng de kleine ronde poort afdichtingen aan op beide poorten. Plaats de dia’s op een drager en breng ze over naar de programmeerbare koel incubator. Inbroed gedurende 90 minuten bij 30 °C voor eiwit expressie, gevolgd door 30 min bij 15 °C voor immobilisatie van het query-eiwit. Was en Blokkeer de dia’s. Verwijder de afdichtings pakking en dompel de dia’s onder in een pipet met ongeveer 30 mL 1x TBST, aangevuld met 5% melk voor eiwit weergave (rubriek 8) of 1x TBST aangevuld met 3% boviene serumalbumine (BSA) voor kinase assays of geneesmiddelen screening (rubriek 9). Inincuberen bij RT met opwinding gedurende 20 minuten en herhaal deze stap 2x. 8. detectie van eiwitten op NAPPA-arrays Primair antilichaam toevoegen. Verwijder de dia’s uit de blokkerende oplossing (stap 7,5) en droog de achterzijde (niet-bedrukte zijde) voorzichtig met een papieren handdoek. Plaats de dia’s op een drager en Breng 600 μL primair antilichaam (muis Anti-Flag) verdund 1:200 in 1x TBST + 5% melk. Incuberen gedurende 1 uur bij RT. Was de glijbanen met 1x TBST + 5% melk op een schommel Shaker (3x voor 5 min elk). Secundair antilichaam toevoegen. Verwijder de glaasjes uit de wasoplossing en droog de achterkant voorzichtig met een papieren handdoek. Plaats de glaasjes op een drager en Breng 600 μL secundair antilichaam (Cy3-labbeled anti-muis antilichaam) verdund 1:200 in 1x TBST + 5% melk. Bescherm de glaasjes tegen licht en incuberen gedurende 1 uur bij RT. Was de glijbanen met 1x TBST op een schommel Shaker (3x voor 5 min elk). Spoel de dia’s snel af met ultrapuur water en droog met perslucht. Ga verder met het scannen (paragraaf 11). 9. onderzoek naar tyrosine kinase remmers op NAPPA arrays Opmerking: meerdere dia’s kunnen worden verwerkt in hetzelfde experiment, maar zorg ervoor dat in elke stap één dia wordt verwerkt op een tijdstip en dat ze niet droog tussen de stappen. Voeg alle oplossingen toe aan het niet-label of niet-specimen einde van de dia. Bereid alle oplossingen voor die tijdens de geneesmiddelen screening worden gebruikt: Bereid de fosfatase/DNase-oplossing voor door het volgende te combineren: 1x proteïne Metallo-fosfatases buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,01% brij 35 bij pH = 7,5); 1 mM MnCl2; 8.000 eenheden van lambda proteïne fosfatase; en 2 eenheden van DNase I. bereid 400 μL van de oplossing voor elke Microarray. Voeg fosfatase en DNase net vóór gebruik toe. Maken van de drug verdunning. Geneesmiddelen worden gereconstitueerd in DMSO tot een eindconcentratie van 10 mM. Om te verzekeren dat alle geneesmiddelconcentraties getest op de array, ervoor zorgen dat hetzelfde volume DMSO (een 10.000 x voorraad in DMSO) wordt gemaakt voor elke concentratie en bewaard bij-80 °C. Op het moment van gebruik, drugs worden verdund 1:100 in water. Bereid de drug/kinase oplossing voor door het volgende te combineren: 1x kinase buffer (25 mM tris-HCl van pH = 7,5); 5 mM Beta-glycerophosphate; 2 mM DTT; 0,1 mM na3vo4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; en 2 μL geneesmiddel (verdund tot 1:100 in water). Bereid 200 μL van de oplossing voor elke Microarray. Voer de fosfatase-en DNase-behandeling uit. Verwijder de dia’s uit de blokkerende oplossing (stap 7,5) en droog de achterkant voorzichtig met een papieren handdoek. Plaats de dia’s op ondersteuning en breng 200 μL fosfatase/DNase-oplossing aan. Plaats een microarray-dekslip om verdamping te voorkomen. Inincuberen bij 30 °C gedurende 45 min in de oven. Fosfatase en DNase behandeling II: Verwijder arrays uit de oven, gooi de afdekplaat weg, Verwijder overtollige oplossing en breng 200 μL vers gemaakte fosfatase-en DNase-oplossing aan. Bedek micro arrays met dekslip en inincuberen voor nog eens 45 min bij 30 °C in de oven. Wassen van dia’s met 1x TBST + 0,2 M NaCl op een schommel Shaker (3x voor 5 min elk). Voer de medicamenteuze behandeling en kinase reactie. Verwijder de dia’s uit de wasoplossing en droog de achterkant voorzichtig met een papieren handdoek. Plaats de dia’s op ondersteuning en breng 200 μL van de drug/kinase oplossing. Plaats een dekslip bovenop om verdamping te voorkomen. Inincuberen gedurende 1 uur bij 30 °C in de oven. Wassen van dia’s met 1x TBST + 0,2 M NaCl op een schommel Shaker (3x voor 5 min elk). Herhaal stap 8.1 – 8.4 met behulp van als primair antilichaam antiphosho-Tyr antilichaam verdund 1:100. Vervang 1x TBST + 5% melk in alle stappen met 1x TBST + 3% BSA. 10. geautomatiseerd hybridisatie Protocol Opmerking: als alternatief kan een hybridisatie station worden gebruikt om alle hybridisatie en wassingen op de NAPPA-arrays te automatiseren (paragrafen 7 – 9) en het protocol wordt geleverd als aanvullend bestand 1. 11. beeld verwerving Opmerking: Microarray-afbeeldingen moeten worden verkregen bij een resolutie van 20 micron of hoger. Laad micro arrays in het tijdschrift van de Slide Holder met de eiwitten naar boven gericht. Laad het magazijn in de microarray scanner. Selecteer de groene laser met een 575/30 nm-emissie filter om het signaal van het met CY-3 gelabelde secundaire antilichaam te scannen. Als een andere de wordt gebruikt, selecteert u de juiste Laser/golflengte om het signaal van de fluorescerende kleurstof te detecteren. Definieer de naam voor elke afbeelding en de locatie die ze zullen worden opgeslagen. (Optioneel): voor elke nieuwe fluorophore wordt optimalisatie van de scan condities aanbevolen om het lineaire bereik van de signaalintensiteit te detecteren. Om dit te doen, scant u een microarray met een bereik van fotomultiplicator (PMT) en Gain totdat een helder beeld wordt verkregen met een niet-verzadigd signaal en een lage achtergrond. Scan alle micro arrays met de geoptimaliseerde instellingen en vergeet niet om de autogain uit te schakelen.Opmerking: voor gegevensanalyse moeten alle micro arrays worden gescand met dezelfde scaninstellingen. Voor kinase assays met behulp van Cy3 als een fluorophore, de beelden worden gescand met een 20% PMT, laserintensiteit van 25%, en 10 micron van de resolutie, met behulp van de scanner vermeld in de tabel van apparatuur en materialen. 12. gegevensverwerking en-analyse Opmerking: verschillende softwarepakketten zijn beschikbaar voor de kwantificering van microarray-gegevens met vergelijkbare mogelijkheden. De hier beschreven procedure is ontworpen voor de software die wordt vermeld in de tabel met apparatuur en materialen. Laad de TIFF-bestanden die moeten worden gekwantificeerd, ontwerp het raster zodat het overeenkomt met de microarray-indeling en pas de grootte van de vlekken aan om het volledige signaal met het minimale gebied mogelijk te maken. Naburige plekken mogen elkaar niet overlappen. Inspecteer visueel hoe goed de software presteert en pas het raster zo nodig handmatig aan. Kwantificeer de signaalintensiteit van de Microarray. Inspecteer de vlekken op afwijkingen (niet-specifieke binding, stof etc.) en verwijder ze uit de gegevensanalyse. Corrigeer de achtergrond lokaal met behulp van het signaal van naburige gebieden op de array waarin geen plek aanwezig is. Normaliseren van gegevens. Om het signaal over verschillende arrays te vergelijken, moet de signaalintensiteit van elke Microarray worden genormaliseerd. Als u uitschieters wilt uitsluiten, Normaliseer de gegevens met behulp van de getrimde gemiddelde 30% van het signaal van de positieve controle (IgG-vlekken) van de gedefosforyleerde micro arrays.Opmerking: het signaal van de IgG-spot verandert niet tijdens de fosforylering en defosforylering van de micro arrays en is geschikt voor de normalisatie. Identificeer actieve kinases. Bereken voor elke functie die wordt weergegeven op de microarray de verhouding tussen de genormaliseerde signaalintensiteit in de autophosphorylated en gedefosforyleerd arrays. Stel een drempel van 1,5-voudige verandering voor de identificatie van de actieve kinases en Markeer alle andere kenmerken als niet in staat om te ondergaan autofosforylatie (N/a). Bereken de activiteit van elk kinase in stap 12,5 geïdentificeerd als een percentage van het gecorrigeerde signaal (signaalintensiteit van de genormaliseerde positieve controle array (DMSO) afgetrokken door de signaalintensiteit van de genormaliseerde negatieve controle array (gedefosforyleerd).

Representative Results

Zelf-geassembleerde NAPPA-micro arrays bieden een solide platform dat kan worden gebruikt voor vele verschillende toepassingen, waaronder biomarkerdetectie, eiwit-eiwit interacties, substraat identificatie en geneesmiddelen screening10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20. De algemene methodologie voor de studie van kinase activiteit en screening van tyrosine kinases-remmers op NAPPA-micro arrays wordt schematisch weergegeven in Figuur 1. Ten eerste worden NAPPA micro arrays gegenereerd door de immobilisatie van cDNA en Capture agent op de gecoate micro arrays. De Cdna’s worden vervolgens gebruikt als een sjabloon voor de transcriptie en vertaling van eiwitten, met behulp van een mens gebaseerde IVTT-systeem, en de nieuw gesynthetiseerde eiwitten worden geïmmobiliseerd door de Capture agent9. De kwaliteit van de gedrukte Microarray kan worden bewaakt door het meten van DNA-niveaus (het bevestigen van consistent printen) of eiwit dat op de array wordt weergegeven (ter bevestiging van de eiwit expressie en-opname; Figuur 1). Om het achtergrond signaal te verlagen en het dynamische bereik van het experiment te vergroten, worden de micro arrays behandeld met 1) Lambda fosfatase om fosforylering van ser/thr/Tyr-residuen te verwijderen, vervolgens met 2) DNase om de chemie ter plaatse te vereenvoudigen en achtergrond (Figuur 1). De volgende stap is de autofosforylatie reactie, waarbij micro arrays worden geïnineerd met kinase buffer in de afwezigheid van ATP (negatieve controle array, aangeduid als gedefosforyleerd micro arrays), en kinase buffer wordt aangevuld met ATP (positieve controle, aangeduid als “autophosphorylated arrays”) of ATP + DMSO (voertuig controle). Er moet worden benadrukt dat tijdens deze stap geen kinase wordt toegevoegd; Daarom wordt de intrinsieke activiteit van elk kinase dat op de microarray wordt weergegeven, gekwantificeerd door meting van zijn fosforylatie niveaus met behulp van een pan anti-fosfostyrosine-antilichaam gevolgd door een Cy3-labbeled secundair antilichaam (Figuur 1). De kwaliteitscontrole van de NAPPA-kinase arrays met een panel van menselijke proteïne kinases, gedrukt in quadruplicaat, wordt weergegeven in Figuur 2. De niveaus van geïmmobiliseerd DNA werden gemeten door DNA-kleuring en het toonde een gelijkmatig signaal over de Microarray, wat suggereert dat de hoeveelheid DNA gedrukt op de array uniform was. Het is ook mogelijk om verschillende functies te observeren zonder enige DNA-kleuring. Deze functies corresponderen met enkele besturingselementen waarin DNA werd weggelaten uit de drukmix [d.w.z. lege vlekken (niets werd gedrukt), watervlekken, gezuiverde IgG-spot (poly-lysine, als en gezuiverde IgG), alleen printen mix (complete Printing mix: poly-lysine Plus als-en Anti-Flag-antilichamen, zonder DNA)]. De op de NAPPA-kinase micro arrays getoonde niveaus van eiwitten werden na de IVTT-reactie beoordeeld met anti-tagantilichamen. Voor de kinase screening, vlag werd gebruikt als de tag van de keuze en het niveau van eiwit weergegeven op de microarray werd gemeten met behulp van een Anti-Flag-antilichaam. Zoals getoond, de meerderheid van de vlekken met cDNA met succes weergegeven detecteerbare niveaus van eiwitten. Sommige van de controle spots zonder cDNA onthulde ook het signaal met het Anti-Flag antilichaam: IgG spot (gebruikt om de activiteit van het secundaire antilichaam te detecteren) en lege Vector vlekken (cDNA-codes voor de tag alleen) (Figuur 2). NAPPA-kinase-micro arrays vertoonden een goede reproduceerbaarheid tussen de dia’s, met de correlatie tussen de niveaus van eiwit weergave en verschillende druk partijen hoger dan 0,88 (figuur 2). Binnen dezelfde batch was de correlatie nog hoger, dicht bij 0,92 (gegevens niet weergegeven). Volgende, de kinase autofosforylatie activiteit van de eiwitten weergegeven op de array werd gemeten met behulp van anti-fosho-tyrosine antilichamen (Figuur 3). Eiwit weergegeven op de array toonde hoge niveaus van eiwit fosforylering na expressie (Figuur 3, links), die kan worden veroorzaakt door intrinsieke kinase activiteit van het eiwit weergegeven op de array of door actieve kinases aanwezig in de ivtt mix. Deze fosforylering werd volledig verwijderd met de Lambda fosfatase behandeling en deze micro arrays werden gebruikt voor de kinase assays. Na defosforylering, autofosforylatie reacties uitgevoerd zonder ATP toonde geen significante niveaus van fosforylering, zoals verwacht, terwijl micro arrays geïnincubeerd met kinase buffer in de aanwezigheid van ATP toonde eiwit fosforylering zo snel als 15 min ( Figuur 3). Voor de geneesmiddelen screening werd de kinase activiteit gemeten na 60 min van de autofosforylatie reactie om het aantal geteste kinases te maximaliseren. De vergelijking tussen micro arrays waarbij de fosforylatie spiegels direct na de eiwit expressie werden gemeten (Figuur 3, links) en na 60 min van de autopfosforylatie reactie (Figuur 3, rechts) toonden: i) eiwitten die alleen fosforyleerd zijn na uitdrukking, suggereren dat ze exogenously fosforyleerd kunnen zijn door eiwitten die aanwezig zijn op de IVTT-mix, maar niet autophosphoryated; II) eiwit fosforyleerd pas na de autofosforylatie reactie, suggereren deze eiwitten waren niet actief na eiwit expressie en vereiste co-factoren aanwezig in de kinase buffer actief te zijn; of III) eiwit fosforyleerd op beide matrices, wat suggereert dat ze actief waren in beide instellingen (Figuur 3). Als voorbeeld van de resultaten verkregen voor de screening van tyrosine kinase remmers op NAPPA-kinase arrays werden drie kinases remmers met een uitgesproken selectiviteit over eiwit kinasen gebruikt: staurosporine, Imatinib en ibrutinib. Voor alle screenings werden gedefosforyleerd nappa-micro arrays geïnincubeerd met toenemende concentraties van TKI (variërend van 100 nm tot 10 uM) tijdens de autofosforylatie-reactie. De eerste TKI getest was staurosporine, een wereldwijde proteïnekinaseremmer, dat toonde krachtige kinase remming op de microarray over vrijwel alle kinasen getest11. Vervolgens werd Imatinib getest, een ABL-en c-Kit-remmer gebruikt voor de behandeling van chronische myeloïde leukemie en gastro-intestinale stromale tumoren4,5,6,7. Op NAPPA-kinase arrays toonde Imatinib een significante afname in Abl1 en BCR-Abl1 activiteit, terwijl andere kinasen grotendeels onaangetast bleven (figuur 4a). De kwantificering van de gegevens voor de kinase activiteit werd genormaliseerd tegen de gedefosforyleerd array en weergegeven als een percentage van de positieve controle Microarray (alleen voertuig). Gegevens voor TNK2 (niet-relevant kinase), Abl1 en BCR-Abl1 worden weergegeven in figuur 4b. Zoals verwacht toonde Imatinib selectieve remming naar Abl1 en BCR-ABl1. De gegevens voor de c-Kit waren onduidelijk vanwege het gebrek aan activiteit op de positieve controle-arrays. Tot slot, ibrutinib, een FDA-goedgekeurde covalente remmer van Bruton tyrosine kinase (BTK), werd getest. Ibrutinib wordt momenteel gebruikt bij de behandeling van verschillende bloedgerelateerde kankers met overactieve BTK, waaronder chronische lymfatische leukemie (CLL), mantelcellymfoom en waldenström’s Waldenström21,22. Figuur 4cis representatief voor de typische resultaten die zijn verkregen voor de screening van ibrutinib. De kinase activiteit van ABL1 (niet-relevant kinase) en BTK (canonieke doel) en ERBB4 (potentieel nieuw doelwit) wordt weergegeven in figuur 4D. De gegevens suggereren ERBB4 kan worden geremd door ibrutinib in een dosis specifieke manier. Deze remming werd bevestigd in vitro en in cel gebaseerde assays11, het demonstreren van de kracht van dit platform. Samen, de gegevens suggereren dat NAPPA-kinase Microarray platform kan worden gebruikt voor de onbevooroordeelde screening van TK-remmers. Bovendien is de screening snel en kan deze gemakkelijk worden aangepast om elke variatie van de eiwit kinases van belang te omvatten. Figuur 1: schematische weergave van kwaliteitscontrole en screening van tyrosinekinaseremmers in NAPPA-arrays. NAPPA-arrays worden bedrukt met cDNA-codering voor het eiwit van de belangstelling gefuseerd met een tag en een Capture-antilichaam. Tijdens de in vitro transcriptie-en vertalings reactie (IVTT) worden de gesynthetiseerde eiwitten op het microarray-oppervlak door de tag opgevangen door het Capture-antilichaam. De kwaliteitscontrole (QC) van de arrays wordt uitgevoerd door de meting van de niveaus van het DNA gedrukt op de glijbaan, met behulp van een fluorescerende DNA-intercalating kleurstof, en de niveaus van eiwit weergegeven op de array met behulp van tag-specifieke antilichamen. Voor de kinase screening worden de micro arrays behandeld met DNase en fosfatase, na de IVTT-reactie, om het gedrukte DNA en alle fosforylering te verwijderen die zich tijdens de eiwitsynthese kunnen hebben voorgedaan. De gedefosforyleerd arrays zijn nu klaar om te worden gebruikt voor het medicijn scherm. Voor elke test worden routinematig drie sets van controles gebruikt: (I) gedefosforyleerd matrices, waarbij de autofosforylatie reactie zonder ATP wordt uitgevoerd; II) autopfosforylated micro arrays, waarbij de autophosphorylatie reactie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van ATP; en (III) DMSO-behandelde array (voertuig), waarin de autofosforylatie-reactie wordt uitgevoerd met ATP en DMSO. De dia’s behandeld met verschillende concentraties van kinase remmers volgen exact hetzelfde protocol dat wordt gebruikt voor de DMSO behandelde arrays. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: representatieve resultaten van kwaliteitscontrole voor zelf-geassembleerde NAPPA-kinase arrays. DNA-gehalte gemeten door een fluorescerende DNA-intercalciërende kleurstof (links) en eiwit niveaus weergegeven op de Microarray, gemeten door Anti-Flag-antilichamen (midden) worden weergegeven. Aan de rechterkant is een correlatie plot van de niveaus van eiwit weergegeven op twee NAPPA-kinase arrays gedrukt in afzonderlijke batches. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: representatieve resultaten van de kinase activiteit in NAPPA-kinase arrays. Micro arrays die eiwit kinasen in quadruplicaat weergeven, werden gebruikt om proteïne kinase activiteit op de array te bestuderen door de meting van eiwit fosforylering met anti-pTyr antilichamen, gevolgd door Cy3-gelabeld anti-muis antilichaam. Control arrays zonder fosfatase/DNase behandeling en zonder ATP tijdens de autofosforylatie reactie werden gebruikt voor het meten van de achtergrond fosforylering na eiwit expressie (post-expressie). De resterende micro arrays werden behandeld met fosfatase/DNA, en de autofosforylatie reactie werd uitgevoerd zonder ATP (gedefosforyleerd Microarray, negatieve controle) of met ATP (autophosphorylated micro arrays). Voor de autophosphoryated micro arrays werd de autofosforylatie reactie uitgevoerd gedurende 15 min, 30 min, 45 min, of 60 min, zoals afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: representatieve gegevens van tyrosine kinase scherm op NAPPA-kinase arrays. (A) fosfatase/DNase behandelde nappa-kinase arrays werden geïnineerd in toenemende concentraties van Imatinib tijdens de autophosphorylatie reactie en de kinase activiteit was maatregel met anti-fosho-Tyr antilichaam. B) kwantificering van de kinase activiteit waargenomen op nappa-kinase arrays blootgesteld aan Imatinib. Gegevens werden genormaliseerd tegen het signaal van de negatieve controle matrices (gedefosforyleerd) en het wordt weergegeven als een percentage van de positieve controle arrays (autophosporylation-reactie uitgevoerd in de aanwezigheid van DMSO). Vergelijkbare gegevens worden getoond voor de screening van ibrutinib (C, D). Dit cijfer is gewijzigd van Rauf et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullend bestand 1. Alternatief protocol voor screening van tyrosine kinase remmers in NAPPA arrays met behulp van een geautomatiseerd hybridisatie station. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Wijzigingen en probleemoplossing
Tijdens de optimalisatie fase van de studie van kinase activiteit op NAPPA-arrays was een van de belangrijkste bronnen van achtergrond en laag dynamisch bereik waargenomen de BSA die op de drukmix werd gebruikt. BSA was het verstrekken van de primaire amines die nodig zijn voor crosslinking met het aminosilaan oppervlak en was het vangen van het DNA en de Capture antilichaam ter plaatse. Echter, BSA is zeer gefosforyleerd, waardoor het moeilijk voor de detectie van de autofosforylatie signaal op de array boven de achtergrondruis. Om dit probleem op te lossen, werden verschillende alternatieven voor BSA in de drukmix getest, en poly-lysine werd geïdentificeerd als goede substituut. Poly-lysine mist geen fosforylatie plaats; Daarom is de achtergrond van niet-uitgedrukt matrices zeer minimaal. Bovendien, micro arrays bedrukt met poly-lysine zijn reproduceerbaar en vertonen goede niveaus van eiwitten (Figuur 2).

De volgende kritische modificatie uitgevoerd op de standaard NAPPA assay was de toevoeging van een fosfatase/DNase behandelings stap. De behandeling van de micro arrays met fosfatase maakt het mogelijk om elke fosforylering die zich in de IVTT-mix heeft voorgedaan tijdens de eiwitsynthese en-opname te verwijderen (Figuur 3). De bron van deze fosforylering kan afkomstig zijn van intrinsieke autopfosforylatie activiteit of van de activiteit van kinasen die aanwezig zijn in de IVTT-mix. Het verwijderen van alle fosforylering post-expressie toegestaan gemakkelijke identificatie van de kinases die actief zijn en kan autofosforylatie ondergaan (Figuur 3).

Kritieke stappen in het Protocol
NAPPA is een robuuste technologie, maar zoals verwacht zijn er verschillende kritieke stappen. De eerste is de verwerving van kwalitatief hoogwaardig DNA in de juiste concentratie. Het gebruik van DNA van slechte kwaliteit of in lage concentraties zal micro arrays van slechte kwaliteit genereren met verschillende functies die niet worden uitgedrukt en weergegeven in de juiste niveaus, waardoor het aantal op de array geanalyseerde eiwitten afneemt. De tweede kritieke stap is de uitdrukking van eiwitten op de Microarray. Het gebruik van een IVTT-systeem dat hoge niveaus van functioneel eiwit zal uitdrukken, is van vitaal belang voor het bestuderen van kinase activiteit op de array.

De volgende kritieke stap op de TKI-screening is hoe de micro arrays worden afgehandeld. De micro arrays moeten niet drogen tijdens elke stap van het Protocol, en een voorzichtige behandeling wordt aanbevolen om krassen te voorkomen die het achtergrond signaal kunnen vergroten. Aangezien de arrays uit het hele experiment tegen elkaar worden vergeleken, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat elke incubatie stap zelfs over alle dia’s gaat. De tijd die nodig is om één stap in één array uit te voeren, moet bijvoorbeeld in aanmerking worden genomen wanneer een batch van 20 arrays wordt verwerkt om te voorkomen dat er verschillen zijn in de lengte van de incubatie tussen matrices.

Tot slot is het ontwerp van het experiment en het opnemen van zowel positieve als negatieve controles van cruciaal belang voor kwaliteitscontrole en gegevensanalyse. De eerste set besturingselementen zijn de afdrukken in elke array en bevat negatieve controles [d.w.z. lege vlekken (zonder materiaal gedrukt), water of lege Vector (alleen de tag uitdrukken)], evenals een positieve controle (d.w.z. gezuiverde IgG, die wordt gedetecteerd door de secundair antilichaam en is inert voor verandering in de fosforylatie niveaus). Gezamenlijk meten ze de achtergrondniveaus van de Microarray, mogelijk overdracht tijdens het printen en de signaalintensiteit van de detectiemethode.

De volgende set van controles zijn de drug screening controles en omvatten de gedefosforyleerd en autophosphorylated micro arrays (in de aanwezigheid of afwezigheid van DMSO). Zoals eerder vermeld, meet de gedefosforyleerd microarray het niveau van fosforylatie na behandeling met fosfatase en dus het Baseline niveau voor alle andere experimenten. Hoe lager het basislijn niveau, hoe hoger het dynamische bereik van de assays. De autophosphorylated arrays presenteren de maximale fosforylatie niveaus van alle arrays en het signaal moet sterk en duidelijk zijn. Het wordt gebruikt voor gegevensanalyse, maar ook als een controle dat alle reacties met succes werden uitgevoerd op de array.

Beperkingen van de techniek
Vanaf nu is een van de beperkingen van de drug screening hier gepresenteerd is de mogelijkheid om alleen te screenen eiwit kinases die kunnen worden autophosphoryated. Een mogelijke manier om dit te overwinnen is om een kinase en bekend substraat op dezelfde plek af te drukken. Co-Printing van DNA voor twee verschillende eiwitten werd met succes gerealiseerd15, wat de haalbaarheid van deze aanpak suggereert. Bovendien kan het eiwit dat op de array wordt weergegeven niet correct worden gevouwen, wat resulteert in een inactief eiwit. Het gebruik van de mens gebaseerde expressie systeem maakte een significante verbetering in de kinase activiteit gemeten op de array; Sommige eiwitten kunnen echter nog steeds niet worden geanalyseerd op de array vanwege de inactiviteit.

Een tweede beperking is de meting van de fosforylering met behulp van een pan anti-fosho-Tyr-antilichaam. Ondanks zijn niet-specificiteit met betrekking tot het motief van de fosforylatieplaats, traden alle gemeten fosforylaties op in tyrosine-residuen, waardoor serines en threonines en hun respectieve kinasen achterblijven. Tot op heden zijn meer dan 10 pan-fosho-ser/thr-antilichamen zonder succes getest, ondanks verschillende pogingen om incubatie-en wascondities te optimaliseren. Een nieuw detectiesysteem dat onafhankelijk is van antilichamen kan de beste optie zijn om het aantal eiwit kinasen dat kan worden gescreend op remming van de drug uit te breiden. In deze context zijn een paar opties beschikbaar, waaronder radioactiviteit of chemische benaderingen zoals Klik conjugatie. Er is een reeks optimalisaties nodig om het achtergrond signaal te minimaliseren en een goed dynamisch bereik voor de assays te bieden.

De derde beperking is de overname van cDNA-klonen die op de array moeten worden gedrukt. De cDNA-klonen kunnen worden gegenereerd met behulp van een kloon techniek, inclusief sitespecifieke recombinatie systemen, zoals Creator of gateway23. Een andere optie is om de klonen van de bibliotheek DNAsu te kopen, te vinden op , waar meer dan 17.000 cDNAs-klonen, inclusief de gehele menselijke kinome, direct beschikbaar is om te worden gebruikt voor de bouw van NAPPA-arrays24 .

De vierde beperking is dat niet elk laboratorium is uitgerust met de juiste apparatuur om hun eigen NAPPA-arrays te fabriceren en te schermen. Dit protocol biedt alternatieve methoden voor het genereren van het DNA dat moet worden afgedrukt op de Microarray, zonder de noodzaak van apparatuur met hoge doorvoer en protocollen om alle hybridisatie stappen handmatig uit te voeren. Echter, toegang tot een arrayer en Microarray scanner is nog steeds nodig. Een optie om dit probleem te verhelpen is om de NAPPA core-service en-faciliteit te gebruiken, te vinden op , die aangepaste NAPPA-micro arrays distribueert tegen een academische prijs zonder winstoogmerk. Ten slotte zijn, vanaf elke screenings methodologie, de op de arrays verkregen gegevens vatbaar voor artefacten (positief of negatief) en moeten daarom worden gevalideerd met behulp van orthogonale assays.

Significantie met betrekking tot bestaande methoden
Verschillende platformen zijn commercieel beschikbaar voor de screening van proteïne kinases. Een aanpak routinematig gebruikt is bindende testen, die kan worden uitgevoerd met eiwit fragmenten, kinase domein, grotere eiwit fragmenten met het kinase domein en sommige regelgevende regio’s, en zelfs volledige-lengte eiwitten. De eiwitten worden meestal uitgedrukt in bacteriële systemen als gevolg van de kosten en eenvoud in de expressie en zuivering protocollen. De interactie tussen de drug van belang en het eiwit wordt vervolgens gemeten met een soort van rapport assay zoals fluorescentie of aanwezigheid van tags, bijvoorbeeld. De belangrijkste beperking van deze reeks benaderingen is het feit dat het eiwit niet noodzakelijkerwijs actief is tijdens de interactie met het medicijn, wat kan resulteren in de identificatie van vals-positieve en vals-negatieve interacties. Eiwit fragmenten zijn bijzonder kwetsbaar voor veranderingen in de conformatie en het gebrek aan activiteit en alle verkregen gegevens moeten worden gevalideerd met behulp van actieve eiwitten, bij voorkeur in de volledige lengte vorm. Een andere beperking van sommige van de platforms is de mogelijkheid om alleen ATP-analogen te schermen, waardoor het totale gebruik ervan wordt beperkt.

Het merendeel van de commercieel beschikbare diensten voor de screening van TKIs met behulp van enzymatische gebaseerde benaderingen maken gebruik van alleen wilde type versies van het kinase van belang, en soms slechts een geselecteerde paar mutanten. Wetende dat de resistentie van de drug is zeer gebruikelijk bij patiënten behandeld met TKI, het is belangrijk om te kunnen meten van de reactie van de drug in verschillende mutanten, voor de selectie van de meest geschikte remmer. Door de natuur van NAPPA is de screening van kinase mutanten eenvoudig en kan gemakkelijk worden bereikt, en de enige vereiste tool is de opname van de kinase mutant in de NAPPA cDNA-collectie, die bijvoorbeeld kan worden gedaan door locatiespecifieke mutagenese.

Toekomstige toepassingen
Een van de meest voorkomende vormen van behandeling verstrijkt in kankertherapie met behulp van kinase remmers is de verwerving van mutaties in het doel van de drug tijdens een behandelingskuur. De screening van deze mutanten met betrekking tot hun reactie op kinase remmers is van vitaal belang voor de selectie van de tweede/derde generatie van TKIs om een gepersonaliseerde behandeling voor elke patiënt te bereiken. De drug screening aanpak hier gepresenteerd, biedt een onbevooroordeelde screening platform waarin elke tyrosine kinase remmer kan worden getest tegen een panel van tyrosine kinases aanwezig in het menselijk genoom. Aangezien de op NAPPA-arrays getoonde eiwitten in vitro worden uitgedrukt uit de cDNA die op de dia zijn gedrukt, kan elke Mutante variant eenvoudig worden opgenomen in de cDNA-collectie die op de array wordt weergegeven. De faciliteit waarin de kinase mutanten kunnen worden gegenereerd en uitgedrukt op de array, gecombineerd met de hoge doorvoer kracht van de NAPPA-techniek, biedt een unieke omgeving voor de studie van kinase mutanten en hun respons op drugs, waardoor NAPPA geschikt is voor gepersonaliseerde drug screening, een van de doelstellingen van Precision Medicine.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen iedereen in het lab van LaBaer bedanken voor hun hulp en kritiek tijdens de ontwikkeling van het project. Dit project werd gesteund door de NIH Grant U01CA117374, U01AI077883 en Virginia G. Piper Foundation.

Materials

Reagent/Material
364 well plates (for arraying) Genetix x7020
800 µL 96-well collection plate Abgene AB-0859
96-pin device Boekel 140500
Acetic Acid Millipore-Sigma 1.00066
Acetone 99.9% Millipore Sigma 650501
Aluminum seal for 96 well plates VWR 76004-236
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) Pierce 80370
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Millipore Sigma F3165
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) Millipore Sigma F7425
ATP 10 mM Cell Signaling 9804S
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Millipore-Sigma G9422
bacteriological agar VWR 97064-336
Blocking Buffer ThermoFisher/Pierce 37535
Brij 35 ThermoFisher/Pierce BP345-500
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) ThermoFisher/Pierce 21580
BSA (bovine serum albumin) Millipore Sigma A2153
Coverslip 24 x 60 mm VWR 48393-106
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-165-150
DeepWell Block, case of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0661
DEPC water Ambion 9906
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Millipore-Sigma D8418
DNA-intercalating dye Invitrogen P11495
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
DTT Millipore-Sigma 43816
EDTA Millipore-Sigma EDS
Ethanol 200 proof Millipore-Sigma E7023
Filter plates Millipore-Sigma WHA77002804
Gas Permeable Seals, box of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0718
Glass box Wheaton 900201
Glass slides VWR 48300-047
Glycerol Millipore-Sigma G5516
HCl (Hydrochloric acid) Millipore-Sigma H1758
HEPES Buffer Solution Millipore-Sigma 83264
Human-based IVTT system Thermo Scientific 88882
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule ThermoFisher/Pierce 31202
Isopropanol Millipore-Sigma I9516
KCl (Potassium chloride) Millipore-Sigma P9333
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) Millipore-Sigma P5655
Kinase buffer Cell Signaling 9802
KOAc (Potassium acetate) Millipore-Sigma P1190
Lambda Protein Phosphatase new england biolabs P0753
Lifterslips, 24 x 60 mm ThermoFisher Scientific 25X60I24789001LS
Metal 30-slide rack with no handles Wheaton 900234
MgCL2 (Magnesium chloride) Millipore-Sigma M8266
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) Millipore-Sigma S6508
NaCl (Sodium Chloride) Millipore-Sigma S3014
NaOAc (Sodium acetate) Millipore-Sigma S2889
NaOH (Sodium hydroxide) Millipore-Sigma S8045
NucleoBond Xtra Midi / Maxi Macherey-Nagel 740410.10 / 740414.10
Nucleoprep Anion II Macherey Nagel 740503.1
Phosphoric Acid Millipore-Sigma 79617
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) Millipore-Sigma A-005-C
Protein Phosphatase (Lambda) New England Biolabs P0753
RNAse Invitrogen 12091021
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma L6026
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma 05030
Sealing gasket Grace Bio-Labs, Inc 44904
Silica packets VWR 100489-246
Single well plate ThermoFisher/Nalge Nunc 242811
Sodium acetate (3M, pH 5.5) Millipore-Sigma 71196
TB media (Terrific Broth) Millipore-Sigma T0918
Tris IBI scientific IB70144
Triton X-100 Millipore-Sigma T8787
Tryptone Millipore-Sigma T7293
Tween 20 Millipore-Sigma P9416
Yeast Extract Millipore-Sigma Y1625
Name Company Catalog number コメント
Equipments Maker/model
Programmable chilling incubator Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling
Shaker for bacterial growth ATR Multitron shaker
Vacuum manifold with liquid waste trap MultiScreenVacuum Manifold 96 well
96 well autopippetor/liquid handler Genmate or Biomek FX
Liquid dispenser Wellmate
DNA microarrayer Genetix QArray2
Automatic hybridization station Tecan HS4800 Pro Hybridization Station
Microarray scanner Tecan PowerScanner
Microarray data quantification Tecan Array-ProAnalyzer 6.3
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).
  2. Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).
  3. Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. FDA-approved small-molecule kinase inhibitors. Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).
  4. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).
  5. Heinrich, M. C., et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 96 (3), 925-932 (2000).
  6. Stagno, F., et al. Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes. Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).
  7. Ben Ami, E., Demetri, G. D. A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor. Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).
  8. Ramachandran, N., et al. Self-assembling protein microarrays. Science. 305 (5680), 86-90 (2004).
  9. Festa, F., et al. Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu. Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).
  10. Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).
  11. Rauf, F., et al. Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner. Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).
  12. Anderson, K. S., et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer. Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).
  13. Wang, J., et al. Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).
  14. Bian, X., et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).
  15. Song, L., et al. Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).
  16. Wang, J., et al. Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules. Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).
  17. Montor, W. R., et al. Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays. Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).
  18. Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).
  19. Yu, X., et al. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).
  20. Anderson, K. S., et al. Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer. Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).
  21. Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL. Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).
  22. Smith, M. R. Ibrutinib in B lymphoid malignancies. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).
  23. Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).
  24. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).

タグ

NAPPAProtein MicroarrayKinase Inhibitor ScreeningHuman ProteinProtein ActivityProtein FunctionHigh-throughputBiomarker DiscoveryProtein-protein InteractionsSubstrate IdentificationDrug ScreeningQuality ControlBacterial GrowthHigh-throughput Mini-prepTerrific Broth MediumAmpicillin96-pin DeviceDeep Well PlateShakerBacterial LysisAnion Exchange Resin Plates

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Festa, F., Labaer, J. Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (152), e59886, doi:10.3791/59886 (2019).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image