Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu
概要
Burada verilen farklı dokulardan ve beynin çeşitli bölgelerinden izole mitokondri ile farklı peptidler ve proteinlerin yerli formu, prefibrillar ve olgun amiloid fibrils arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.
Abstract
Kanıt büyüyen bir vücut membran permeabilizasyon gösterir, mitokondri gibi iç membranlar da dahil olmak üzere, nörodejeneratif hastalıklarda amiloid agrega kaynaklı toksisite ortak bir özellik ve birincil mekanizma. Ancak, membran bozulma mekanizmaları açıklayan raporların çoğu fosfolipid model sistemlerine dayanmaktadır ve biyolojik membranlar düzeyinde meydana gelen olayları doğrudan hedefleyen çalışmalar nadirdir. Burada açıklanan membran düzeyinde amiloid toksisite mekanizmaları incelemek için bir modeldir. Mitokondriyal izolasyon için, yoğunluk gradyan ortamı minimal miyelin kontaminasyonu ile preparatlar elde etmek için kullanılır. Mitokondriyal membran bütünlüğü doğruladıktan sonra α-sinüklein, büyükbaş insülin ve tavuk yumurtası aknüksü (HEWL) ile sıçan beyni mitokondrisinden kaynaklanan amiloid fibrillerin in vitro biyolojik model olarak etkileşimi araştırılır. Sonuçlar fibriller meclisleri ile beyin mitokondri tedavisi membran permeabilizasyon ve ROS içerik geliştirme farklı derecelerde neden olabileceğini göstermektedir. Bu amiloid fibriller ve mitokondriyal membran arasındaki yapıya bağlı etkileşimleri gösterir. Amiloid fibrillerin biyofiziksel özellikleri nin ve mitokondriyal membranlara özel bağlanmasının bu gözlemlerin bazılarına açıklama getirebileceği ileri sürülebilir.
Introduction
Amiloidoz olarak bilinen amiloid ile ilişkili bozukluklar, farklı doku ve organlarda çözünmez protein yataklarının görünümü ile tanımlanan hastalıkların büyük bir grup oluşturmaktadır1,2. Bunlar arasında nörodejeneratif bozukluklar, protein agregalarının merkezi veya periferik sinir sisteminde en sık görülen formlardır2. Amiloid agregalarının toksisitesi dahil olduğu öne sürülse de3, amiloid patolojisinin birincil mekanizması olarak hücre zarının bozulması na ve permeabilizasyonuna işaret eden kanıt ların giderek arttığı bir vücut4, 5. Plazma zarına ek olarak, iç organeller (yani, mitokondri) de etkilenebilir.
İlginçtir, ortaya çıkan kanıtlar mitokondriyal disfonksiyon nörodejeneratif bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları da dahil olmak üzere6,7. Bu soruna uygun olarak, çok sayıda rapor bağlanma ve amiloid β-peptid birikimi göstermiştir, α-sinüklein, Huntingtin, ve ALS bağlı mutant SOD1 proteinleri mitokondri8,9,10, 11. Amiloid agregalar tarafından membran permeabilizasyon mekanizması ya ayrık kanalların oluşumu ile meydana geldiği düşünülmektedir (gözenekleri) ve / veya nonspesifik bir deterjan benzeri mekanizma ile5,12, 13. yıl. Bu sonuçların çoğunun fosfolipid model sistemlerini içeren raporlara dayandığı ve biyolojik membranlarda meydana gelen olayları doğrudan hedef alan çalışmaların nadir olduğu dikkat çekicidir. Açıkçası, Bu yapay lipid iki katmanları mutlaka biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmaz, mitokondri olanlar da dahil olmak üzere, heterojen yapılar ve fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede oluşan.
Bu çalışmada, sıçan beyinlerinden izole edilen mitokondri, α-sinükleinden kaynaklanan amiloid fibrillerin (amiloidojenik protein olarak), sığır insülininin (bir model peptid olarak gösteren bir model peptid olarak) yıkıcı etkilerini incelemek için in vitro biyolojik bir model olarak kullanılmaktadır. enjeksiyon lokalize amiloidoz dahil insan insülin ile önemli yapısal homoloji), ve tavuk yumurtası beyaz lysozyme (HEWL; amiloid agregasyon çalışması için ortak bir model protein olarak). Amiloid fibriller tarafından indüklenen mitokondriyal membranların etkileşimleri ve olası hasarı mitokondriyal magenaz (MDH) (mitokondriyal matrikste bulunan) ve mitokondri reaktif oksijen salınımı gözlemleyerek araştırılır. türler (ROS) geliştirme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel sonuçlar zenginliği fibriller agregaların sitotoksisitesi önemli ölçüde etkileşim ve biyolojik membranlar 4 permeabilize yetenekleri ile ilişkili olduğu hipotezini destekler4,5. Ancak, verilerin çoğu mutlaka fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede heterojen yapılar olan biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmayan yapay lipid iki katmanları dayanmaktadır. Burada beyin mitokondrisi in vitro biyolojik membran olarak …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İran’ın Zanjan kentinde ki Temel Bilimler İleri Araştırmalar Enstitüsü Araştırma Konseyi’nin (IASBS) hibeleri ile desteklenmiştir.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
参考文献
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
- Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. 生化学. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. 生化学. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
