אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils
概要
בתנאי זה הוא פרוטוקול לחקירת האינטראקציות בין הצורה הטבעית, prefibrillar, ו-עמילואיד בוגרים של פפטידים וחלבונים שונים עם המיטו, מבודדים מרקמות שונות ואזורים שונים של המוח.
Abstract
גוף הולך וגדל של ראיות מעיד על חדירות הממברנה, כולל קרומים פנימיים כגון המיטוגרם, היא תכונה נפוצה המנגנון העיקרי של רעילות המושרה עמילואיד במחלות ניווניות. עם זאת, רוב הדיווחים המתארים את המנגנונים של שיבוש הממברנה מבוססים על מערכות מודל פוספוליפיד, ומחקרים המכוונים ישירות לאירועים המתרחשים ברמת הקרומים הביולוגיים הם נדירים. המתואר כאן הוא מודל ללמוד את המנגנונים של רעילות עמילואיד ברמת הקרום. עבור בידוד מיטוכונדריאלי, צפיפות בינונית הדרגתי משמש להשגת ההכנות עם זיהום מיאלין מינימלי. לאחר אישור מיטוכונדריאלי שלמות הממברנה, האינטראקציה של העמילואיד סיבים עולה מ α-synuclein, אינסולין השור, ו ביצת חן לבן ליזוזים (hewl) עם המוח עכברוש המיטוa, כמו מודל ביולוגי מבחנה, הוא נחקר. התוצאות להפגין כי הטיפול של המיטו, המוח עם הרכבות fibrillar יכול לגרום לדרגות שונות של חדירות הקרום ו-ROS שיפור תוכן. הדבר מצביע על אינטראקציות תלויות-מבנה בין עמילואיד בקרום מיטוכונדריאלי. הוא הציע מאפיינים ביופיזיים של העמילואיד והכריכה הספציפית שלהם לקרומים מיטוכונדריאלי עשויים לספק הסברים לחלק מתצפיות אלה.
Introduction
הפרעות הקשורות עמילואיד, המכונה amyloidoses, מהווים קבוצה גדולה של מחלות המוגדרים על ידי מראה של פיקדונות חלבון מסיסים ברקמות שונות ואיברים1,2. ביניהם, הפרעות ניווניות הן הצורות התכופות ביותר שבהן מופיעות אגרגטים חלבונים במערכת העצבים המרכזית או ההיקפית2. למרות מספר מנגנונים הוצעו להיות מעורב רעילות של אגרגטים עמילואיד3, גוף גדל והולך של ראיות מצביע על שיבוש קרום התא והחדירות כמנגנון העיקרי של מחלות עמילואיד4, 5. המשך בנוסף קרום פלזמה, אורגלים פנימיים (כלומר, המיטו,) יכול להיות גם מושפע.
מעניין, הראיות המתעוררים עולה כי תפקוד מיטוכונדריאלי משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של הפרעות ניווניות, כולל אלצהיימר ו פרקינסון מחלות6,7. בהתאם לבעיה זו, דיווחים רבים הצביעו על כריכה וצבירה של עמילואיד β-פפטיד, α-synuclein, huntingtin, ו-ALS מקושר מוטציה SOD1 חלבונים כדי המיטומטר8,9,10, 11. המנגנון של חדירות הממברנה על ידי מצרפים של עמילואיד נחשב להתרחש או באמצעות היווצרות של ערוצים נפרדים (נקבוביות) ו/או באמצעות מנגנון ניקוי שאינו מסוים כמו סבון5,12, . שלוש עשרה ראוי לציין כי מרבית המסקנות הללו התבססו על דוחות הכרוכים במערכות מודל פוספוליפיד, ומחקרים המכוונים ישירות לאירועים המתרחשים בקרומים ביולוגיים הם נדירים. ברור, אלה שומנים מלאכותיים מלאכותי לא בהכרח משקפים את התכונות הפנימיות של ממברנות ביולוגיים, כולל אלה של המיטו, אשר הם מבנים הטרוגנית מורכב מגוון רחב של פוספוליפידים וחלבונים.
במחקר הנוכחי, המיטו, מבודדים מן המוח חולדה משמשים כמודל ביולוגי בלתי מתורבת כדי לבחון את ההשפעות ההרסניות של העמילואיד סיבים הנובעים α-synuclein (כמו חלבון amyloidogenic), שור אינסולין (כמו פפטיד מודל מראה הומולוגיה מבנית משמעותית עם אינסולין אנושי מעורב עמילואידוזיס הזרקת מקומי), וביצת חן לבן ליזוזים (hewl; כחלבון מודל נפוץ לחקר מצבור עמילואיד). האינטראקציות והנזק האפשרי של ממברנות מיטוכונדריאלי הנגרמת על ידי העמילואיד נחקרים לאחר מכן על ידי התבוננות שחרורו של המאלף מיטוכונדריאז (MDH) (ממוקם במטריקס מיטוכונדריאלי) וחמצן תגובתי המיטוגרמה שיפור מיני (ROS).
Protocol
Representative Results
Discussion
שפע של תוצאות ניסיוני תומך ההשערה כי רעילות ציטוהfibrillar של אגרגטים משויך באופן משמעותי עם יכולתם לתקשר עם הממברנות ביולוגיות4,5. עם זאת, רוב הנתונים מבוססים על bilayers השומנים מלאכותי שאינם משקפים בהכרח את המאפיינים הפנימיים של ממברנות ביולוגיים, אשר הם מבנים ה?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ממועצת המחקר של המכון ללימודים מתקדמים במדעי היסוד (IASBS), זנג’אן, איראן.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
参考文献
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
- Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. 生化学. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. 生化学. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
