概要

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Published: August 09, 2019
doi:

概要

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Abstract

A diferenciação ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas é um modelo amplamente utilizado para estudar a hematopoiese. O protocolo descrito aqui é para a diferenciação induzida citocinas de pilhas da haste e do progenitor de CD34+ hematopoietic às quatro pilhas myeloid da linhagem. As pilhas de CD34+ são isoladas do sangue humano do cabo de cordão umbilical e co-cultivadas com as pilhas STROMAL MS-5 na presença de cytokines. A caracterização de immunophenotypic das pilhas da haste e do progenitor, e as pilhas Myeloid diferenciadas da linhagem são descritas. Usando este protocolo, as pilhas de CD34+ podem ser incubadas com moléculas pequenas ou transadas com lentivirus para expressar mutações myeloid da doença para investigar seu impacto na diferenciação Myeloid.

Introduction

A diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é fundamental para a manutenção de níveis fisiológicos de todas as linhagens de células sanguíneas. Durante a diferenciação, em uma resposta coordenada às pistas extracelulares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, as hscs primeiro dão origem a células de progenitoras multipotentes (MPP) que têm potencial lympho-mielóide1,2,3 ,4 (Figura 1). Os MPPs dão origem a progenitores mielóides comuns (CMPs) e progenitores linfoides comuns (CLPs) que são restritos à linhagem. Os CLPs diferenciam nas linhagens lymphoid compostas de B, T, e de pilhas naturais do assassino. Os CMPS geram as linhagens Myeloid através de duas populações mais restritas do progenitor, dos progenitores Erythroid do megacariócito (deputados), e dos progenitores do monocyte do granulocyte (GMPs). Os eurodeputados dão origem a megacariócitos e eritrócitos, enquanto os GMPs dão origem a granulócitos e monócitos. Além do que levanta-se com CMPS, os megacariócitos foram relatados para levantar-se também diretamente de hscs ou de Mpps adiantados através das vias não-canônicas5,6.

As células tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são caracterizadas pelo marcador de superfície CD34 e pela falta de marcadores específicos de linhagem (Lin). Outros marcadores de superfície comumente empregados para distinguir HSCs e populações de progenitoras mielóides incluem CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). HSCs e MPPs são Lin/Cd34+/CD38 e Lin/CD34+/CD38+, respectivamente. As populações de progenitoras comprometidas mielóides distinguem-se pela presença ou ausência de CD45RA e CD123. As CMPS são Lin/CD34+/CD38+/CD45RA/CD123lo, os GMPs são Lin/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, e os eurodeputados são Lin/CD34+ /Cd38+/Cd45ra/CD123.

A população total de células CD34+ Stem e progenitoras pode ser obtida a partir do sangue do cordão umbilical humano (UCB), da medula óssea e do sangue periférico. As células CD34+ constituem 0, 2% a 1,46% das células mononucleares totais (MNCs) em UCB humano, enquanto a sua percentagem varia entre 0,5% e 5,3% na medula óssea e é muito mais baixa em ~ 0, 1% no sangue periférico7,8,9 . A capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação das células CD34+ derivadas de UCB é significativamente maior do que a da medula óssea ou das células sanguíneas periféricas1,10, oferecendo assim uma vantagem distinta para obter material suficiente para análises moleculares em combinação com a realização de caracterização imunofenootípica e morfológica das células durante a diferenciação.

A diferenciação ex vivo do sangue do cordão umbilical CD34+ hspcs é um modelo amplamente aplicado para a investigação de hematopoiese normal e mecanismos de doença hematopoética. Quando cultivadas com as citocinas apropriadas, a UCB CD34+ hspcs pode ser induzida para diferenciar ao longo das linhagens mielóide ou linfoide11,12,13,14,15 , 16. aqui, nós descrevemos protocolos para a isolação e a caracterização immunophenotypic do CD34+ HSPCS do UCB humano, e para sua diferenciação às pilhas myeloid da linhagem. Este sistema da cultura é baseado na diferenciação cytokine-induzida dos HSPCs na presença de pilhas stromal MS-5 para imitar o microambiente na medula. As condições da cultura causam uma expansão inicial das pilhas de CD34+ , seguidas por sua diferenciação às pilhas que expressam marcadores para as quatro pilhas myeloid da linhagem, a saber os granululocytes (CD66b), os monócitos (CD14), os megacariócitos (CD41), e eritrócitos (CD235a). As aplicações do protocolo de diferenciação celular CD34+ incluem estudos sobre mecanismos moleculares que regulam a hematopoiese, e investigações sobre o impacto de mutações associadas à doença mielóide e pequenas moléculas na autorenovação e diferenciação de HSPCs.

Protocol

O sangue do cordão umbilical humano para experimentação foi doado por indivíduos sadios após consentimento informado para a Maricopa sistemas integrados de saúde (MIHS), Phoenix. As unidades desidentificadas foram obtidas por meio de um acordo de transferência de material entre a MIHS e a Universidade do Arizona. 1. reagentes e amortecedores Nota: Prepare todos os reagentes e tampões condições estéreis em um armário de segurança biológic…

Representative Results

A aplicação dos protocolos acima rende 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs e 1 (± 0,3) x 106 células CD34+ de uma unidade de sangue do cabo de ~ 100 ml. A percentagem de células CD34+ totais varia entre 80-90% (Figura 2A, B). A análise imunofenotípica pelo esquema descrito por Manz et al.5 demonstra que as células CD34+ tipicamente consistem em ~ 20% hscs e ~ 72% Mpps que são Lin-/Cd34<sup…

Discussion

O protocolo descrito aqui é apropriado para a diferenciação ex vivo de UCB derivado CD34+ hspcs às quatro linhagens Myeloid. A incubação inicial com uma mistura de citocina consistindo de SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula as células CD34+ . Subseqüentemente, a diferenciação é conseguida com um cocktail de SCF, de IL3, de Flt3L, de EPO, e de TPO. Nesta mistura, o SCF, o IL3, e o Flt3L são importantes para a sobrevivência e a proliferação de CD34+ hscs. ePO e TPO promovem a dife…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero, e Gabriella Ruiz de Maricopa sistemas integrados de saúde para as unidades de sangue de cabo de-identificado e doado, Mrinalini Kala para assistência com citometria de fluxo, e bandidos gays e Christopher seet para aconselhamento sobre diferenciação mielóide ex vivo. Este trabalho foi apoiado por fundos para S.S. dos institutos nacionais de saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e da sociedade americana de câncer (a pesquisa institucional Grant 74-001-34-IRG). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Materials

0.4% Trypan blue solution Thermo Fisher Scientific 15250-061 Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 Gibco  15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14185052 Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol red Thermo Fisher Scientific 15090046 Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filters Miltenyi biotech 130-041-407
35% sterile Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7979
7-AAD Biolegend 420404 Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) Biolegend 312207 Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) Biolegend 301403 Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) Biolegend 306012 Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) Biolegend 301806 Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) BD Biosciences 347543 Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) BD Biosciences 551336 Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) Biolegend 306609 Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) Biolegend 343514 Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) Biolegend 303506 Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) Biolegend 300405 Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) Biolegend 303720 Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) Biolegend 304126 Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) Biolegend 305116 Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) Biolegend 343103 Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine  Gibco 12100046 Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated Omega Scientific FB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit  Miltenyi biotech 130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research grade Miltenyi biotech 130-094-011 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 2 mM concentration in stimulation medium
LS Columns Miltenyi biotech 130-042-401
MACS Multi stand Miltenyi biotech 130-042-303
MidiMACS magnetic separator Miltenyi biotech 130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) GE Healthcare Biosciences 17-1440-03
MS-5 cells Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ml
Poly-L lysine Sigma-Aldrich P2636 Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) BioBasic RC213-15 Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) Takara  T100B Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) BioBasic RC214-16 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) BioBasic RC212-14 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) BioBasic RC213-12 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15) Lonza  04-418Q
Sodium bicarbonate Fisher Scientific BP328-500
Wright-Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich WG16-500 Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometer BD Biosciences
Centrifuge Sorvall Legend RT
Light microscope Olympus

参考文献

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記事を引用
Bapat, A., Keita, N., Sharma, S. Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (150), e59836, doi:10.3791/59836 (2019).

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