Differenziazione pan-mieloide del sangue di cordone umano Derivato CD34- Cellule staminali eseminazioni e progenitrici
概要
Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione immunofenotipica e la differenziazione citochina indotta del sangue cordonale derivato CD34– cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ai quattro lignaggi mieloidi. Le applicazioni di questo protocollo includono indagini sull’effetto delle mutazioni della malattia mieloide o di piccole molecole sulla differenziazione mieloide del CD34– cellule.
Abstract
La differenziazione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche umane è un modello ampiamente utilizzato per studiare l’ematopoiesi. Il protocollo qui descritto è per la differenziazione indotta da citochine di CD34– cellule staminali ematopoietiche e progenitrici alle quattro cellule di lignaggio mieloidi. CD34– Le cellule sono isolate dal sangue del cordone ombelicale umano e co-coltivate con cellule stromali MS-5 in presenza di citochine. La caratterizzazione immunofenotipica delle cellule staminali e progenitrici e le cellule di lignaggio mieloide differenziate sono descritte. Utilizzando questo protocollo, CD34– Le cellule possono essere incubate con piccole molecole o trasdotte con lentivirus per esprimere mutazioni della malattia mieloide per studiare il loro impatto sulla differenziazione mieloide.
Introduction
La normale differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) è fondamentale per il mantenimento dei livelli fisiologici di tutte le linee delle cellule del sangue. Durante la differenziazione, in una risposta coordinata a segnali extracellulari, compresi fattori di crescita e citochine, gli HSC danno prima origine a cellule progenitrici multipotenti (MPP) che hanno un potenziale linfo-mieloide1,2,3 ,4 (Figura 1). I PMP danno origine a progenitori mieloidi comuni (CMP) e a progenitori linfoidi comuni (CLP) con restrizioni di lignaggio. I CLP si differenziano nelle linee linfoidi composte da B, T e cellule killer naturali. I CMP generano le linee mieloidi attraverso due popolazioni progenitrici più ristrette, i progenitori di eritroidi megakaryocyte (MEMP) e i progenitori del monocito del granulocita (GMP). I deputati danno luogo a megakaryociti ed eritrociti, mentre i GMP danno origine a granulociti e monociti. Oltre a sorgere attraverso CP, sono stati segnalati megakaryociti che sorgono anche direttamente dagli HSC o dai primi PMP attraverso percorsi non canonici5,6.
Le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) sono caratterizzate dal marcatore superficiale CD34 e dalla mancanza di marcatori specifici di lignaggio (Lin–). Altri indicatori di superficie che sono comunemente impiegati per distinguere le popolazioni di HSC e progenitrici mieloidi includono CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). Gli HSC e gli MMP sono rispettivamente Lin,/CD34,/CD38– e Lin–/CD34,/CD38,, e . Le popolazioni progenitorie impegnate da mieloidi si distinguono per la presenza o l’assenza di CD45RA e CD123. I CMP sono Lin–/CD34,/CD38,/CD45RA–/CD123lo, i GMP sono Lin–/CD34,/CD38,/CD45RA,/CD123lo, e i deputati al PE sono Lin–/CD34 /CD38:/CD45RA–/CD123–.
La popolazione totale di cellulestaminali e progenitrici CD34 può essere ottenuta dal sangue del cordone ombelicale umano (UCB), dal midollo osseo e dal sangue periferico. Lecellule CD34 costituiscono lo 0,02% all’1,46% delle cellule mononucleari totali (MNC) nell’UCB umano, mentre la loro percentuale varia tra lo 0,5% e il 5,3% nel midollo osseo ed è molto più bassa allo 0,01% nel sangue periferico7,8,9 . La capacità proliferale e il potenziale di differenziazione dellecellule CD34 derivate dall’UCB è significativamente superiore a quello del midollo osseo o delle cellule del sangue periferiche1,10, offrendo così un netto vantaggio per ottenere un vantaggio distinto per ottenere materiale sufficiente per analisi molecolari in combinazione con l’esecuzione di immunofenotipica e caratterizzazione morfologica delle cellule durante la differenziazione.
La differenziazione dell’ex vivo del sangue del cordone ombelicale derivato da CD34– HSPC è un modello ampiamente applicato per studiare la normale ematopoiesi e i meccanismi della malattia ematopoietica. Quando viene coltivato con le citochine appropriate, l’UCB CD34– HSPC può essere indotto a differenziarsi lungo le linee mieloidi o linfoidi11,12,13,14,15 , 16. Qui, descriviamo i protocolli per l’isolamento e la caratterizzazione immunofenotipica del CD34– HSPC dall’UCB umano, e per la loro differenziazione alle cellule di lignaggio mieloidi. Questo sistema di coltura si basa sulla differenziazione degli HSPC indotta da citochine in presenza di cellule stromali MS-5 per imitare il microambiente nel midollo osseo. Le condizioni di coltura causano un’espansione iniziale dellecellule CD34, seguita dalla loro differenziazione alle cellule che esprimono marcatori per le quattro cellule di lignaggio mieloidi, vale a dire granulociti (CD66b), monociti (CD14), megakaryociti (CD41) e eritrociti (CD235a). Le applicazioni del protocollo di differenziazionecellulare CD34 include studi sui meccanismi molecolari che regolano l’ematopoiesi e le indagini sull’impatto delle mutazioni associate alla malattia mieloide e delle piccole molecole sull’auto-rinnovamento e differenziazione degli HSPC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è adatto per la differenziazione ex vivo di CD34 derivati dall’UCBe hSPC ai quattro lignaggi mieloidi. L’incubazione iniziale con un mix di citochine composto da SCF, TPO, Flt3L e IL3 stimola lecellule CD34. Successivamente, la differenziazione si ottiene con un cocktail di SCF, IL3, Flt3L, EPO e TPO. In questo mix, SCF, IL3 e Flt3L sono importanti per la sopravvivenza e la proliferazione di CD34– HSCs. EPO e TPO promuovono la differenziazione verso gli eritro…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Wendy Barrett, Rachel Caballero e Gabriella Ruiz di Maricopa Integrated Health Systems per le unità di sangue cordonale de-identificate e donate, Mrinalini Kala per l’assistenza con la citometria di flusso, e Gay Crooks e Christopher Seet per consigli sulla differenziazione dei mieloidi ex vivo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi per S.S. dal National Institutes of Health (R21CA170786 e R01GM127464) e dall’American Cancer Society (il Institutional Research Grant 74-001-34-IRG). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
参考文献
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