概要

Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Published: August 09, 2019
doi:

概要

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.

Abstract

Die Ex-vivo-Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Hämatopoese. Das hier beschriebene Protokoll ist für die zytokininduzierte Differenzierung von CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Abstammungszellen. CD34+ Zellen werden aus menschlichem Nabelschnurblut isoliert und in Gegenwart von Zytokinen mit MS-5 Stromalzellen kokultiviert. Die immunotypische Charakterisierung der Stamm- und Vorläuferzellen sowie der differenzierten myeloischen Abstammungszellen werden beschrieben. Mit diesem Protokoll können CD34+ Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert oder mit Lentiviren transduziert werden, um myeloische Krankheitsmutationen auszudrücken, um ihre Auswirkungen auf die myeloische Differenzierung zu untersuchen.

Introduction

Die normale Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Werte aller Blutkörperchen. Während der Differenzierung, in einer koordinierten Reaktion auf extrazelluläre Hinweise einschließlich Wachstumsfaktoren und Zytokine, HSCs zuerst entstehen multipotente Vorläuferzellen (MPP) Zellen, die lympho-myeloides Potenzialhaben 1,2,3 ,4 (Abbildung 1). MPPs führen zu gemeinsamen myeloischen Vorläufern (CMPs) und gemeinsamen lymphoiden Vorläufern (CLPs), die Abstammungsbeschränkungen sind. CLPs unterscheiden sich in die lymphoiden Linien, die aus B, T und natürlichen Killerzellen bestehen. CMPs erzeugen die myeloischen Abstammungen durch zwei eingeschränkte Vorläuferpopulationen, MegakaryozytenerErythroid-Vorläufer (MEP) und Granulozytenmonozytenvorläufer (GMPs). Die MdEP führen zu Megakaryozyten und Erythrozyten, während GSP Granulozyten und Monozyten hervorrufen. Zusätzlich zu den Durchgängen durch CMPs, Megakaryozyten wurden berichtet, dass auch direkt aus HSCs oder frühen MPPs über nicht-kanonische Wege5,6.

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) zeichnen sich durch den Oberflächenmarker CD34 und das Fehlen von linienspezifischen Markern (Lin) aus. Andere Oberflächenmarker, die häufig zur Unterscheidung von HSCs und myeloiden Vorläuferpopulationen verwendet werden, sind CD38, CD45RA und CD1232 (Abbildung 1). HSCs und MPPs sind Lin/CD34+/CD38 und Lin/CD34+/CD38+, bzw. Myeloide engagierte Vorläuferpopulationen zeichnen sich durch das Vorhandensein oder Fehlen von CD45RA und CD123 aus. CMPs sind Lin/CD34+/CD38+/CD45RA/CD123lo, GMPs sind Lin/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, und MePs sind Lin/CD34+ /CD38+/CD45RA/CD123.

Die Gesamtpopulation von CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen kann aus menschlichem Nabelschnurblut (UCB), Knochenmark und peripherem Blut gewonnen werden. CD34+ Zellen machen 0,02 % bis 1,46 % der gesamten mononukleären Zellen (MNCs) im menschlichen UCB aus, während ihr Anteil zwischen 0,5 % und 5,3 % im Knochenmark schwankt und im peripherenBlutmit 0,01 % viel niedriger ist 7,8,9 . Die proliferative Kapazität und das Differenzierungspotenzial von UCB-abgeleiteten CD34+ Zellen ist signifikant höher als die der Knochenmark- oder peripheren Blutkörperchen1,10, wodurch ein deutlicher Vorteil für die ausreichendes Material für molekulare Analysen in Kombination mit der durchführung immunophenotypic und morphologischen Charakterisierung der Zellen während der Differenzierung.

Ex-vivo-Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ HSPCs ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der normalen Hämatopoese und hämatopoetischen Krankheit Mechanismen. Bei Kultur mit den entsprechenden Zytokinen können die UCB CD34+ HSPCs induziert werden, um entlang der myeloischen oder lymphoiden Linien11,12,13,14,15 zu unterscheiden , 16. Hier beschreiben wir Protokolle zur Isolierung und immunphänotypischen Charakterisierung der CD34+ HSPCs aus humanem UCB und für deren Differenzierung zu myeloischen Abstammungszellen. Dieses Kultursystem basiert auf der zytokininduzierten Differenzierung von HSPCs in Gegenwart von MS-5-Stromalzellen, um die Mikroumgebung im Knochenmark nachzuahmen. Die Kulturbedingungen führen zu einer anfänglichen Ausdehnung der CD34+ Zellen, gefolgt von deren Differenzierung zu Zellen, die Marker für die vier myeloischen Abstammungszellen ausdrücken, nämlich Granulozyten (CD66b), Monozyten (CD14), Megakaryozyten (CD41) und Erythrozyten (CD235a). Anwendungen des CD34+ Zelldifferenzierungsprotokolls umfassen Studien über molekulare Mechanismen zur Regulierung der Hämatopoese und Untersuchungen der Auswirkungen von myeloiden Krankheitsmutationen und kleinen Molekülen auf die Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs.

Protocol

Menschliches Nabelschnurblut zum Experimentieren wurde von gesunden Personen nach informierter Zustimmung zu Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix gespendet. Die identifizierten Einheiten wurden durch eine Materialtransfer-Vereinbarung zwischen MIHS und der University of Arizona erhalten. 1. Reagenzien und Puffer HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien und Puffer unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank vor. <…

Representative Results

Die Anwendung der oben genannten Protokolle ergibt 5,6 (ca. 0,5) x 108 MNCs und 1 (ca. 0,3) x 106 CD34+ Zellen aus einer Nabelschnurbluteinheit von 100 ml. Der Prozentsatz der gesamten CD34+ Zellen liegt zwischen 80-90% (Abbildung 2A,B). Die immunotypische Analyse nach dem von Manz et al.5 beschriebenen Schema zeigt, dass die CD34+ Zellen in der Regel aus 20 % HSCs und 72 % MPPs bestehen, die Lin<…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll eignet sich zur ex vivo-Differenzierung von UCB-abgeleiteten CD34+ HSPCs zu den vier myeloischen Linien. Die anfängliche Inkubation mit einem Zytokin-Mix bestehend aus SCF, TPO, Flt3L und IL3 stimuliert die CD34+ Zellen. Anschließend wird die Differenzierung mit einem Cocktail aus SCF, IL3, Flt3L, EPO und TPO erreicht. In diesem Mix sind SCF, IL3 und Flt3L wichtig für das Überleben und die Proliferation von CD34+ HSCs. EPO und TPO fördern die Differenz…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Wendy Barrett, Rachel Caballero und Gabriella Ruiz von Maricopa Integrated Health Systems für die entidentifizierten und gespendeten Nabelschnurbluteinheiten, Mrinalini Kala für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Gay Crooks und Christopher Seet für Beratung zur ex-vivo-Myeloiddifferenzierung. Diese Arbeit wurde durch Mittel unterstützt, die S.S. von den National Institutes of Health (R21CA170786 und R01GM127464) und der American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) erhielten. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Materials

0.4% Trypan blue solution Thermo Fisher Scientific 15250-061 Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 Gibco  15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14185052 Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol red Thermo Fisher Scientific 15090046 Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filters Miltenyi biotech 130-041-407
35% sterile Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7979
7-AAD Biolegend 420404 Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) Biolegend 312207 Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) Biolegend 301403 Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) Biolegend 306012 Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) Biolegend 301806 Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) BD Biosciences 347543 Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) BD Biosciences 551336 Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) Biolegend 306609 Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) Biolegend 343514 Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) Biolegend 303506 Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) Biolegend 300405 Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) Biolegend 303720 Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) Biolegend 304126 Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) Biolegend 305116 Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) Biolegend 343103 Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine  Gibco 12100046 Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated Omega Scientific FB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit  Miltenyi biotech 130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research grade Miltenyi biotech 130-094-011 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 2 mM concentration in stimulation medium
LS Columns Miltenyi biotech 130-042-401
MACS Multi stand Miltenyi biotech 130-042-303
MidiMACS magnetic separator Miltenyi biotech 130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) GE Healthcare Biosciences 17-1440-03
MS-5 cells Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ml
Poly-L lysine Sigma-Aldrich P2636 Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) BioBasic RC213-15 Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) Takara  T100B Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) BioBasic RC214-16 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) BioBasic RC212-14 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) BioBasic RC213-12 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15) Lonza  04-418Q
Sodium bicarbonate Fisher Scientific BP328-500
Wright-Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich WG16-500 Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometer BD Biosciences
Centrifuge Sorvall Legend RT
Light microscope Olympus

参考文献

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記事を引用
Bapat, A., Keita, N., Sharma, S. Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (150), e59836, doi:10.3791/59836 (2019).

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