Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

O cérebro é um circuito intrincado de células neuronais e não-neuronais. Durante anos, os cientistas têm tentado obter informações sobre esta maquinaria complexa. Para isso, os neurocientistas recorreram inicialmente a várias linhagens celulares transformadas em nervo para investigações. No entanto, a incapacidade dessas linhagens de células clonais de formar conexões sinápticas fortes e axônios ou dendritos adequados mudaram o interesse científico para as culturas primárias do neurão^1,2. O aspecto mais excitante da cultura do neurônio primário é que ele cria uma oportunidade para observar e manipular os neurônios vivos³. Além disso, é menos complexa em comparação com o tecido neural, o que o torna um candidato ideal para estudar a função e o transporte de várias proteínas neuronais. Recentemente, vários desenvolvimentos nas áreas de microscopia, genômica e proteômica têm gerado novas oportunidades para os neurocientistas explorarem as culturas neurais⁴.

As culturas primárias permitiram que os neurocientistas explorem os mecanismos moleculares por trás do desenvolvimento neural, analisem várias vias de sinalização neural e desenvolvam uma compreensão mais coerente da sinsicose. Embora uma série de métodos relataram culturas de neurônios primários (principalmente a partir da origem hipocampal^5,6,7),um protocolo unificado com um meio quimicamente definido que permite a cultura de longo prazo de neurônios é ainda necessário. Entretanto, os neurônios chapeados em uma baixa densidade são observados o mais frequentemente, que não sobrevivem a longo prazo, provavelmente devido à falta do apoio trófico⁸ que é fornecido pelos neurônios adjacentes e pelas pilhas glial. Alguns métodos sugeriram até mesmo a coculturação dos neurônios primários com células gliais, onde as células gliais são usadas como uma camada de alimentador⁹. Entretanto, as pilhas glial levantam muitos problemas devido a seu overgrowth, que substituem às vezes o crescimento neuronal¹⁰. Assim, considerando os problemas acima, é necessário um protocolo de cultura neural primária mais simples e rentável, que pode ser usado tanto por neurobiólogos quanto por neuroquímicos para investigações.

Uma cultura primária de neurónios é essencialmente uma forma de cultura 2D e não representa a plasticidade, a integridade espacial ou a heterogeneidade do cérebro. Isso tem dado origem à necessidade de um modelo 3D mais crível chamado neuroesferas^11,12. As neuroesferas apresentam uma nova plataforma para os neurocientistas, com uma semelhança mais estreita com o cérebro real, in vivo¹³. As neuroesferas são aglomerados 3D não aderentes de células que são ricas em células-tronco neurais (NSCs), células progenitoras neurais (NPCs), neurônios e astrócitos. Eles são uma excelente fonte para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras neurais, que podem ser usadas para estudar a diferenciação em várias linhagens neuronais e não-neuronais. Outra vez, a variabilidade dentro das culturas da neurofera produzidas usando os protocolos previamente relatados apresenta uma barreira à formulação de um protocolo unificado da cultura da neurofera¹⁴.

Este manuscrito apresenta um protocolo em que é possível gerar ambas as plataformas 2D e 3D alternando densidades do chapeamento de pilha de uma cultura cortical e hippocampal misturada. Observa-se que dentro de 7 dias as neuroesferas livres-flutuantes são obtidas dos neurônios chapeados high-density isolados do embrião do rato de E14-E16 Sprague Dawley, que em cima da cultura mais adicional, formam pontes e interconexões através das extensões glial-como radiais. Similarmente, nos neurônios chapeados da baixa densidade, uma cultura preliminar do neurônio que possa ser mantida por até 30 dias é obtida mudando o meio da manutenção duas vezes por a semana.