הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש
概要
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.
Abstract
תרבות תא העצב העיקרי היא טכניקה חיונית בתחום המוח. כדי לזכות בתובנות מכניסטיות עמוקות יותר במוח, חיוני להיות בעלי מודל מתורבת שניתן לנצל למחקרים שונים בנוירוביולוגיה. למרות התרבויות הראשיות של תא העצב (כלומר, לטווח ארוך בתרבויות ההיפוקמפוס) סיפקו מדענים עם דגמים, הוא עדיין לא מייצג את המורכבות של רשת המוח לחלוטין. בעקבות מגבלות אלה, מודל חדש התפתחה באמצעות נוירוספירות, אשר נושא דמיון קרוב יותר לרקמת המוח. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ציפוי של צפיפות גבוהה ונמוכה של קליפת המוח המעורב ואת הנוירונים היפוקמאל מבודדים מן העובר של היום העובריים 14-16 החולדות של הג דאוד. זה מאפשר את הדור של נוירוספירות ותרבות תא העצב העיקרי לטווח ארוך כמו שתי פלטפורמות עצמאיות לבצע מחקרים נוספים. תהליך זה הוא פשוט מאוד חסכוני, כפי שהוא ממזער מספר שלבים וריאגנטים שנחשבו בעבר חיוני לתרבות העצב. זהו פרוטוקול יציב עם דרישות מינימליות שניתן לבצע עם תוצאות השגה ושימוש נוסף עבור מגוון של מחקרים הקשורים למדעי המוח.
Introduction
המוח הוא מעגל מורכב של תאים עצביים ולא עצביים. במשך שנים, מדענים מנסים. להשיג תובנה במכונות המורכבות האלה כדי לעשות זאת, מדענים נוירו, בתחילה נקטו בקווים שונים של תאי עצב מבוססי העצבים לחקירות. עם זאת, חוסר היכולת של הקווים האלה תא שבטים ליצור קשרים סינפטית חזקים ואקסונים הנכון או דנדטים העבירו עניין מדעי לתרבויות תא העצב העיקרי1,2. ההיבט המרגש ביותר של תרבות תא העצב העיקרי הוא שזה יוצר הזדמנות להתבונן ולתפעל נוירונים חיים3. כמו-כן, היא מורכבת פחות לעומת רקמת העצבים, מה שהופך אותו למועמד אידיאלי לחקר התפקוד וההובלה של חלבונים עצביים שונים. לאחרונה, מספר התפתחויות בתחומים של מיקרוסקופ, גנומיקה, ו פרוטאומניקס יצרו הזדמנויות חדשות עבור נוירומדענים לנצל את תרבויות תא העצב4.
התרבויות הראשיות הרשו לנוירומדענים לחקור את המנגנונים המולקולריים שמאחורי ההתפתחות העצבית, לנתח מסלולים שונים של אותות עצביים, ולפתח הבנה ברורה יותר של synapsis. למרות שמספר שיטות דיווחו על תרבויות מפני הנוירונים הראשוניים (בעיקר ממקור ההיפוקמאל5,6,7), פרוטוקול אחיד עם מדיום מוגדר כימית המאפשר תרבות ארוכת טווח של נוירונים הוא עדיין צריכים עם זאת, נוירונים מצופה בצפיפות נמוכה מתבוננים בדרך כלל, אשר לא לשרוד לטווח ארוך, כנראה בשל חוסר תמיכה הזנה8 כי הוא סיפק את הנוירונים הסמוכים תאים גליה. שיטות מסוימות אפילו הציע co-culturing של הנוירונים העיקריים עם תאים גליה, שבו התאים גליה משמשים כשכבת ממזין9. עם זאת, תאים גליה להוות הרבה בעיות עקב צמיחת יתר שלהם, אשר לפעמים לעקוף את הצמיחה עצבי10. מכאן, בהתחשב בבעיות לעיל, חובה פשוטה וחסכונית יותר הפרוטוקול העיקרי התרבות העצבית נדרשת, אשר ניתן להשתמש הן נוירוביולוגים והן נוירוכימאים לחקירות.
תרבות תא העצב העיקרית היא למעשה צורה של תרבות דו-ממדית ואינה מייצגת את הפלסטיות, השלמות המרחבית, או הטרוגניות של המוח. זה נתן את הצורך במודל תלת-ממד אמין יותר בשם נוירוספירות11,12. נוירוספירות להציג פלטפורמה רומן מדענים נוירו, עם דמיון קרוב יותר למציאות, במוח vivo13. נוירוספירות הם לא מחסיד אשכולות תלת-ממד של תאים עשירים בתאי גזע עצביים (NSCs), בתאי מחולל קדמון (NPCs), נוירונים, ו astrocytes. הם מקור מצוין עבור בידוד של תאי גזע עצביים ותאים מחולל קדמון, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול לתוך שונים עצביים ושאינם עצביים. שוב, השונות בתוך תרבויות נוירוספירה המיוצר באמצעות הפרוטוקולים שדווחו קודם לכן מציג מחסום לניסוח של פרוטוקול נוירוספירה מאוחדת התרבות14.
כתב יד זה מציג פרוטוקול שבו ניתן ליצור הן 2D ו-3D פלטפורמות על ידי הציפוי תאים מתחלפים משולב של קליפת המוח מעורב היפוקמאל. הוא ציין כי בתוך 7 ימים חופשי-צפה נוירוספירות מתקבלים מפני נוירונים בצפיפות גבוהה מצופה מבודדים מ-E14-E16 ספראג העובר עכברוש דטרלי, אשר על תרבות נוספת, גשרים טופס והתקשרויות באמצעות הרחבות מדומה glial-. באופן דומה, בצפיפות נמוכה מצופה נוירונים, תרבות תא העצב העיקרי שניתן לשמור עד 30 ימים מושגת על ידי שינוי המדיום תחזוקה פעמיים בשבוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד על ידי שינוי צפיפויות הציפוי של תאים של נוירונים ראשוניים, שני פלטפורמות עצבי משתנה מתקבלים. למרות זאת היא שיטה פשוטה, כל צעד צריך להתבצע בקפדנות כדי להשיג את התוצאות הרצויות. שיטות קודמות אחרות דיווחו על תרביות נוירונים בטווח הארוך או בתרבויות נוירוספירה. רוב הפרוטו…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים CSIR-IICB מתקן בעלי חיים. ד. נ. תודה ICMR, J. K. ו-V. G תודה שעון השראה, ו D. M. תודה DBT, הודו עבור המלגות שלהם. ס. ג. באדיבות מודה סרבית (EMR/2015/002230) הודו למתן תמיכה כספית.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
参考文献
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
