대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석
概要
여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.
Abstract
세포 자 멸은 자연 스러운 과정으로 서 배아 발달, 항상성 조절, 면역 내성 유도 및 염증의 해결에 중요 한 역할을 한다. 바디에 있는 사 멸 파편의 축적은 시간이 지남에 따라 전신 자기 면역 질병으로 이끌어 내는 만성 선 동적인 반응을 시작할 수 있습니다. 손상 된 사 멸 세포 클리어런스는 다양 한 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 사 멸 클리어런스는 생리학적 조건에서 거의 검출 되지 않는 복잡 한 과정입니다. 그것은 풍부한 표면 수용 체 및 신호 분자를 포함 한다. 사 멸 세포 클리어런스 과정을 연구 하는 것은 통찰력 있는 분자 메커니즘과 후속 생물학적 반응을 제공 하 여 새로운 치료제의 발달로 이어질 수 있습니다. 여기에서 우리는 사 멸 티 모 세포의 유도를 위한 프로토콜, 복 막 대 식 세포의 준비, 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에의 한 사 멸 세포 클리어런스 분석을 설명 합니다. 모든 세포는 특정 단계에서 아 폽 토시 스를 겪을 것 이며, 많은 주거 및 순환 세포는 사 멸 파편을 흡수 할 수 있다. 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 많은 다른 세포 유형에 의해 사 멸 세포 결합 및 섭취를 특성화 하기 위해 여러 응용 프로그램에서 사용 될 수 있습니다.
Introduction
우리 몸은 매일 1-10 억 사 멸 세포를 생성 합니다. 이러한 많은 수의 사 멸 세포는 면역 반응이 정지 상태를 유지 하는 방식으로 지워야 합니다. 적시에 사 멸 세포의 틈새를 지키기 위하여는, 조직 주민 세포의 수많은 모형 및 회람 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 하는 기계 장치를 개발 합니다1. 아 폽 토시 스의 기능 장애 조절은 다양 한 염증 성 질환 및 자기 면역의 발병 및 진행에 연루 되어 있다2. 아 폽 토시 스는 또한 종래의 치료법3,4에 대 한 그의 후속 내성 및 암 발병의 발병 기 전에 서 중요 한 역할을 한다. 사 멸 세포의 제거는 일반적으로 면역 내성5에 연결 될 수 있는 항 염증 반응을 촉진 합니다. 사 멸 세포 클리어런스의 교란은 자기 면역을 촉진 하 고 인간 및 생쥐6의 전신 자가 면역 질환의 발병에 기여 합니다.
세포가 아 폽 토시 스를 겪을 때, 그들은 포스 파티 딜 세 린 (PtdSer)을 내부 리플 렛에서 멤브레인의 외부 리플 렛에 노출 시킵니다. PtdSer는 표면 수용 체를 통해 식 세포에 의해 인식 될 것입니다. 12 개 이상의 수용 체는 사 멸 세포의 침 몰을 인식 및/또는 촉진 하는 것으로 확인 되었습니다. 일반적으로, 사 멸 세포 클리어런스에 관여 하는 표면 수용 체의 적어도 3 가지의 종류가 있습니다: 테 더 링 수용 체, 사 멸 세포를 인식; 수용 체 간 질, 침 몰 시작; 수용 체, 전체 과정을 용이 하 게7. 탐 수용 체 티로신 키나 제 (TAM RTKs)는 Tyro-3, xl 및 Mer로 구성 되 고 주로 면역 시스템 (8)의 골수성 세포에 의해 표현 된다. TAM RTKs의 주된 기능은 테 더 링 수용 체 역할을 하 여 사 멸 세포와 파편의 포식 제거를 촉진 하는 것입니다. 우리 그룹은 수 년 동안 자동 면역의 설정에서 TAM 매개 사 멸 세포 클리어런스를 연구 했습니다. 비타민 K-의존성 단백질 성장 체포 특이 단백질 6 (Gas6) 및 단백질 S (프로)는 탐 수용 체를 결합 및활성화 시킨다. Gas6는 심장, 신장 및 폐에서 생산 됩니다. 프로는 주로 간에 서 생산11. TAM은 Gas6/프로의 N-말단이 사 멸 세포에 PtdSer에 결합 하 고 Gas6/프로의 C-말단을 식 세포의 표면에 부착 된 탐 수용 체에 결합 하는 방식으로 사 멸 셀을 인식 한다. 다른 수용 체와 함께, 사 멸 세포의 침 몰은 발생12. Mer는 리간드 프로와 Gas6 모두에 결합할 수 있지만, 우리는 항-메 르 항 체 (13)에 의해 차단 될 수 있는 사 멸 세포에 대 한 mer 매개 식 세포의 포식에 대 한 유일한 리간드 인 것으로 Gas6 것으로 나타났습니다. 대 식 세포는 전문 포식 세포입니다. 식 세포에의 한 사 멸 세포의 급속 한 클리어런스는 세포내 항 원에 대 한 염증 및 자가 면역 반응의 억제에 중요 합니다. Mer 수용 체 티로신 키나 아 제는 대 식 세포 침 적 및 효율적인 사 멸 셀 (14)의 클리어런스에 중요 하다. 마우스 비장에서 Mer는 주로 한계 구역과 유형 신체 대 식 세포13에 대해 표현 합니다.
여기에 제시 된 프로토콜은 세포 사 멸을 유도 하 고 efferocytosis의 과정과 효율성을 측정 하는 방법을 입증 하는 기본적인 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 기원의 사 멸 세포의 침 몰에서 다른 세포 유형에 의해 efferocytosis를 연구 하기 위하여 쉽게 적응 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 사 멸은 많은 신호 캐스케이드를 수반 하 고 단백질 발현, 분 비 및 수송을 유도 하는 고도로 보존 된 세포 사 멸 과정 이다. 아 폽 토시 스는 종종 세포 형태학 변화 (17)와 연관 된다. 사 멸 세포는 사이트에 이주 하 고 엄격한 통제18에서 매우 복잡 한 통로의 과정을 시작 하는 포식을 유치 하는 사이토카인 및 케 모카 인를 활발히 풀어 놓습니다. 한편, 괴 사…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Shao 연구소에서 연구는 의학의 대학에서 연구 혁신 상을 지원 하 고 내과, 신시내티 대학과 NIDDK/NIH에서 DK K01_095067에서 주니어 학부 조종사 상을 수상.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
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